2020-06-01
研究菌(jun)(jun)(jun)群多(duo)樣(yang)(yang)性(xing)(xing)組成譜主要是(shi)以細(xi)菌(jun)(jun)(jun)/古(gu)菌(jun)(jun)(jun) 16S rRNA基(ji)因(yin)可(ke)變區、真(zhen)菌(jun)(jun)(jun) 18S rRNA 基(ji)因(yin)可(ke)變區或真(zhen)菌(jun)(jun)(jun) ITS（Internal transcribed spacer）內(nei)轉錄間(jian)隔(ge)區等微(wei)生物(wu)(wu)(wu)(wu)特征序列(lie)（Signature sequence）為靶點，通過檢測(ce)序列(lie)的(de)(de)(de)(de)變異(yi)和數量(liang)，反映菌(jun)(jun)(jun)群中各類(lei)微(wei)生物(wu)(wu)(wu)(wu)物(wu)(wu)(wu)(wu)種(zhong)的(de)(de)(de)(de)身份和豐度，從而快速解碼菌(jun)(jun)(jun)群物(wu)(wu)(wu)(wu)種(zhong)分(fen)布(bu)特征，闡(chan)明樣(yang)(yang)本(ben)(ben)間(jian)多(duo)樣(yang)(yang)性(xing)(xing)和組成差異(yi)，進(jin)而發(fa)現差異(yi)相關物(wu)(wu)(wu)(wu)種(zhong)。菌(jun)(jun)(jun)群的(de)(de)(de)(de)物(wu)(wu)(wu)(wu)種(zhong)分(fen)布(bu)與所(suo)取得的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)有很大(da)的(de)(de)(de)(de)相關性(xing)(xing)，所(suo)以樣(yang)(yang)本(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)收集和處理環節對(dui)后續的(de)(de)(de)(de)結果至關重(zhong)要，今天主要來聊下針(zhen)對(dui)不同的(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)有什么樣(yang)(yang)不同的(de)(de)(de)(de)取樣(yang)(yang)策略。
取(qu)樣(yang)前(qian)要做哪些(xie)準備呢？
不同的(de)(de)樣(yang)本取樣(yang)時(shi)的(de)(de)準(zhun)備會有差異，但是大部分(fen)都會涉及(ji)到如下：
1. 取樣用品準備：由于所取樣本不同，需要準備的取樣器材不同，包括但不局限于經過滅菌的采血管、鑷子、EP管、鏟子等。
2. 取樣前對樣本的處理：若是固體整塊的樣本，建議用無菌器材切取有代表性的部分；若是液體樣本，建議混勻后取樣；若是粉末樣本，建議邊取邊混等，確保樣本的均勻性。
3. 取樣前或取樣后：在盛有樣本的容器上做好標記，密封，適當溫度保存。
土壤污泥類樣本要怎么取樣？
1. 根據研(yan)究(jiu)目的確定采(cai)樣范圍，去除表面浮(fu)土(tu)，挖取(qu)地下5~20cm的土層。
2. 去除可見雜質(zhi)，土壤過(guo)2mm篩網，每(mei)個樣品從3個及以(yi)上采樣點采集并混合而成(cheng)，每(mei)1～5g分(fen)(fen)為一份袋裝(zhuang)保存；或(huo)取200-500mg分(fen)(fen)裝(zhuang)到2ml滅菌(jun)EP管中(zhong)，足(zu)(zu)夠(gou)滿足(zu)(zu)一次(ci)實(shi)驗(yan)需求，同(tong)時根據實(shi)驗(yan)要求做(zuo)好備份；避(bi)免運輸過(guo)程中(zhong)樣品出現散漏(lou)等異常情況，置于(yu)低溫保存。
3. 污泥樣品在取樣時(shi)，需(xu)直(zhi)接(jie)混勻；沙土(tu)類微生物(wu)含(han)量相對少，可以多備些(xie)樣本(ben)，每5～10g為一份，袋裝保存。
糞便類樣本要怎么取樣？
一、人類糞便
方法一：
1. 準備(bei)好便(bian)(bian)盆(pen)或糞便(bian)(bian)容器，洗(xi)手，帶上(shang)手套(tao)收集新鮮的糞便(bian)(bian)樣本，糞便(bian)(bian)樣本中盡量無尿液。
2. 用無菌牙(ya)簽或糞便取樣器截取樣品(pin)中段里部(bu)（糞便表(biao)層含有(you)腸粘膜脫落細胞(bao)），外部(bu)容易污染，且接(jie)觸空(kong)氣后，部(bu)分細菌 DNA 開(kai)始(shi)降(jiang)解(jie)。
3. 用滅菌離心管每管稱取(qu)約0.2g左右糞便樣本，每個(ge)樣本取(qu)多管備份。
4. 分裝好后，若當(dang)天提取DNA，可(ke)以(yi)先放4°C，長期存放需先迅速放入液(ye)氮(dan)中，之后立(li)即放入-80°C保(bao)存。
方法二：（推薦）推薦使用等分析管技術
1. 將(jiang)糞便(bian)直接排便(bian)到無菌容器中，如(ru)果有條(tiao)件(jian)，可當(dang)場進行(xing)后續操作，如(ru)果沒條(tiao)件(jian)可將(jiang)樣本(ben)在低溫下運(yun)輸，收(shou)集(ji)后48小時運(yun)輸到實(shi)驗室操作。
2. 使用(yong)(yong)吸(xi)(xi)管在(zai)糞便(bian)中反復(fu)插入(ru)，直到用(yong)(yong)均勻的(de)(de)混合物和最小的(de)(de)氣(qi)穴填(tian)(tian)充(chong)吸(xi)(xi)管；若在(zai)糞便(bian)樣(yang)(yang)品太軟或(huo)(huo)水分太多(duo)而無法填(tian)(tian)充(chong)吸(xi)(xi)管的(de)(de)情況下(xia)，使用(yong)(yong)無菌1ml注(zhu)射器(qi)。吸(xi)(xi)管或(huo)(huo)者注(zhu)射器(qi)有刻(ke)度，每(mei)次(ci)能確保取樣(yang)(yang)量(liang)相同。
提示：取樣最好在生物安全柜(ju)中(zhong)進(jin)行。
二、小鼠糞便
分別收取目的小鼠的糞便(bian)，立即進(jin)行(xing)收取，盡量不要暴(bao)露在空(kong)氣中太長時間，避免污染和降(jiang)解。
水體怎么(me)取(qu)樣？
1. 根據研究目的確定采樣深度和范圍。
2. 采集好的水樣需要通過濾膜進行過濾，可以根據水樣的渾濁程度選擇相應孔徑的濾膜（清亮水樣：可選擇小孔徑的濾膜，一般選0.22μm或0.45μm的濾膜，過濾水樣體積大 于10L；渾濁水樣：過濾前靜置分離懸浮顆粒，也可以用大孔徑的濾膜預過濾一遍，再用小孔徑的濾膜進行過濾）。
3. 根據實驗需要做好備份，同時將濾膜-80℃保存備用。
食品類樣(yang)本怎么取(qu)樣(yang)？
1. 小包裝類(lei)樣品盡可能取原包裝，直到(dao)實驗前(qian)不(bu)要開封(feng)，以(yi)防污染。
2. 固體類(lei)樣(yang)品最好(hao)在不同部位采樣(yang)，一起放入(ru)滅菌(jun)離心管或者其他無菌(jun)容器保(bao)存。
3. 液體(ti)(ti)類樣品，取樣前盡(jin)量搖動混勻(yun)，放(fang)入15ml滅菌離心管，不要超過體(ti)(ti)積的四分(fen)之(zhi)三，防止曝管。
研究表面微生物的應該怎么取樣？
1. 對于(yu)形狀(zhuang)較小的(de)物體，直接將其(qi)放(fang)入無菌(jun)的(de)容器中，加入PBS進(jin)行(xing)沖洗(xi)，振蕩(dang)使微生物脫落到PBS中；取液體放(fang)入滅(mie)菌(jun)離心管，-80℃保存備用(yong)。
2. 對于大的物(wu)體建議(yi)采(cai)用(yong)無(wu)(wu)菌棉簽沾取(qu)無(wu)(wu)菌水擦拭(shi)物(wu)體表面取(qu)樣(yang)，擦拭(shi)時在表面緩慢旋轉涂抹擦拭(shi)幾(ji)次，建議(yi)多擦拭(shi)幾(ji)個(ge)拭(shi)子；或用(yong)無(wu)(wu)菌手(shou)術(shu)刀片輕輕刮取(qu)物(wu)體表面取(qu)樣(yang)，將棉簽或刮取(qu)物(wu)放(fang)入滅菌離心(xin)管，-80℃保(bao)存備(bei)用(yong)。
研究植物內生菌應該怎么取樣？
1. 用流(liu)水沖洗植物根樣本表面(mian)并(bing)摘(zhai)掉小(xiao)側根，粘根土壤顆(ke)粒等以后(hou)對樣本進(jin)行化學消毒（95%的(de)次(ci)氯(lv)酸鈉最少2min）。
2. 把(ba)樣本放入含有無(wu)菌(jun)玻(bo)璃珠的(de)無(wu)菌(jun)水中劇(ju)烈搖晃(huang)，物理去除(chu)表面細(xi)菌(jun)。
3. 取出(chu)樣本后用手術刀片劃開根(gen)部表(biao)面，切取內部組(zu)織(zhi)。
4. 把切取后的組織放入含有無菌玻璃珠(zhu)的9%的生(sheng)(sheng)理(li)鹽水中振蕩，在30℃的條件下振蕩4h以分(fen)離內生(sheng)(sheng)菌。
5. 用5μm濾膜(mo)過濾，15000rpm，4℃離(li)心(xin)收(shou)集沉淀，長期存(cun)放(fang)需先迅速放(fang)入 液(ye)氮中(zhong)，之后立即(ji)放(fang)入-80°C保存(cun)。
血液樣本怎么取樣？
1. 采集新鮮血(xue)液(ye)于含有(you)EDTA的(de)抗凝(ning)管中；顛倒數次混(hun)勻血(xue)液(ye)和EDTA。
2. 常溫3000rpm離心15min，棄上層血漿。
3. 下層(ceng)血細胞分裝到(dao)EP管內，并標記好樣品名稱和日期保存在-20℃冰箱。
環境樣本怎么取樣？
1．自然(ran)沉降(jiang)法：利用(yong)空(kong)氣微生物顆粒的(de)重力作(zuo)用(yong)，在一定時間內，讓所處區域(yu)的(de)微生物顆粒逐步(bu)沉降(jiang)到收集器皿（不推薦(jian)）。
2．使用(yong)各類抽氣裝(zhuang)置，針(zhen)對實驗(yan)目的空(kong)氣微(wei)顆(ke)粒，用(yong)不同孔(kong)徑大小的無菌濾膜篩選(xuan)目的顆(ke)粒，多次收集備用(yong)；將含(han)顆(ke)粒過濾膜裝(zhuang)入無菌鋁箔內，密封在-80℃長期保存。
口腔樣本怎(zen)么取樣？
一、唾液樣本
1. 取樣前30分鐘(zhong)，無進食(shi)、吸煙(yan)等動(dong)作。
2. 采(cai)樣之(zhi)前要用(yong)雙手按摩(mo)臉頰兩側(ce)，盡可能的用(yong)舌頭多(duo)刮幾次(ci)上下顎，同時也可以用(yong)牙齒稍微(wei)的刮一下舌頭，保證脫落細胞的數量，使唾(tuo)液流入唾(tuo)液采(cai)集(ji)管(guan)中。
二(er)、口(kou)腔(qiang)內組織(zhi)樣本(ben)
1. 口腔內組織的(de)取樣建(jian)議用樣本采集拭(shi)子，確(que)保在(zai)所要取樣部分反復擦拭(shi)最少10秒。
2. 采集后的(de)拭子放入無菌管(guan)低溫保存。
呼(hu)吸道樣本(ben)怎么取樣？
一、上呼吸道
建議鼻拭(shi)子或者咽拭(shi)子，放保(bao)存液(ye)中保(bao)存。
二、下呼吸道
推薦支氣管(guan)鏡取樣(yang)：內(nei)窺鏡伸到氣道中的“楔子”，徐徐滴入生理鹽(yan)水，再抽吸出來并捕(bu)獲。保(bao)存在滅菌離心管(guan)-80℃備用(yong)。
三、痰液
盡(jin)量少(shao)帶唾(tuo)液，獲得痰液后可以加(jia)入二(er)硫蘇糖醇來稀釋樣本。
腸道內容物怎么取樣？
1. 在實驗對象死亡后，用無菌解剖刀，在無菌狀態下取出整個腸道，切取所需腸段的內容物（條件允許的(de)話，可在無菌操作臺進(jin)行）。
2. 用無(wu)菌(jun)手術刀挖取內容物，立即(ji)放在冰上進行(xing)分(fen)裝(zhuang)并標記。
3. 用(yong)滅菌(jun)離心管分裝，單個(ge)樣(yang)(yang)本取(qu)樣(yang)(yang)量(liang)：0.2-0.5g/管。為保證(zheng)實驗(yan)順利進行(xing)，每(mei)個(ge)樣(yang)(yang)本取(qu)多管備份，在采樣(yang)(yang)允許的情況(kuang)下，盡(jin)量(liang)多采集樣(yang)(yang)品(pin)。
