2020-06-08
蛋(dan)白質的(de)(de)相互(hu)作(zuo)用是生命(ming)活(huo)動的(de)(de)基(ji)(ji)礎，一切生命(ming)活(huo)動幾乎都是通過蛋(dan)白質之間的(de)(de)相互(hu)作(zuo)用而實(shi)現的(de)(de)。在(zai)生物體發育的(de)(de)不同階(jie)段，細(xi)(xi)胞分裂、分化(hua)的(de)(de)不同時期(qi)，都離不開蛋(dan)白質間的(de)(de)相互(hu)作(zuo)用。近年，隨著(zhu)分子生物學技術的(de)(de)發展(zhan)，人們(men)對基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)結構和功能(neng)的(de)(de)認(ren)識不斷加深，尤(you)其是基(ji)(ji)因(yin)組研究的(de)(de)飛速進展(zhan)，為揭(jie)示生命(ming)的(de)(de)奧(ao)秘提(ti)供了條件。然而，只憑借基(ji)(ji)因(yin)序列很難(nan)認(ren)識蛋(dan)白質的(de)(de)功能(neng)及(ji)在(zai)整個細(xi)(xi)胞中所(suo)處的(de)(de)位置和作(zuo)用。
酵(jiao)母(mu)雙(shuang)雜交(jiao)作(zuo)為(wei)發現(xian)和研(yan)究(jiu)在活細胞體內的(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)與蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)之間(jian)(jian)(jian)的(de)相互(hu)作(zuo)用的(de)技(ji)術，在近幾年來(lai)得(de)到(dao)了(le)廣(guang)泛運用。酵(jiao)母(mu)雙(shuang)雜交(jiao)系(xi)統(tong)是在真核(he)模式生物酵(jiao)母(mu)中進行的(de)，研(yan)究(jiu)活細胞內蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)相互(hu)作(zuo)用，對蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)之間(jian)(jian)(jian)微弱的(de)、瞬間(jian)(jian)(jian)的(de)作(zuo)用也能(neng)夠(gou)通過報(bao)告基因的(de)表(biao)達產物敏(min)感(gan)地檢測得(de)到(dao)。它(ta)是一種具有很高靈敏(min)度的(de)研(yan)究(jiu)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)之間(jian)(jian)(jian)關系(xi)的(de)技(ji)術。
酵母雙雜交系統是建立在人們對酵母轉錄因子GAL4的認識基礎上的。一個完整的酵母轉錄因子GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結構域：位于N端1~174位氨基酸區段的DNA結合域（DNA-BD）和位于C端768~881位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別位于GAL4效應基因的上游激活序列(UAS)并與之結合，而AD則是通過與轉錄機構中的其他成分之間的結合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉錄。研究人員發現DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上極為接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。根據這一特性，后期實驗人員開發了兩種質粒，一種是BD質粒（含有GAL4的DNA結(jie)合域），另一種是AD質粒（含有GAL4的(de)轉錄激(ji)活域(yu)）。如需驗證蛋白之間的相互作用，只需要將2種蛋白質（X/Y蛋白）分別構建出BD-X質粒載體和AD-Y質粒載體，將2個重組質粒載體共轉化至酵母體內表達。判斷通過報告基因表達與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。
酵母雙雜(za)交原理圖(tu)
說了一(yi)些酵(jiao)母雙雜的(de)原理，那如(ru)何(he)利用這個優(you)勢(shi)呢，下(xia)面的(de)話，就帶大家來看下(xia)具體是怎么應用的(de)吧（具體參考Yeast two-hybrid screening for proteins that interact with PFT in wheat [2]）！
赤霉(mei)病（FHB）是(shi)世界范圍內(nei)的(de)(de)毀(hui)滅性(xing)(xing)小(xiao)麥(mai)疾病。而(er)與小(xiao)麥(mai)FHB抗性(xing)(xing)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)的(de)(de)是(shi)Fhb1上的(de)(de)成孔毒素(su)（PFT）基(ji)因(yin)。在這(zhe)項研究(jiu)中(zhong)(zhong)，使用(yong)從小(xiao)麥(mai)赤霉(mei)病菌(jun)感染的(de)(de)蘇麥(mai)3號(hao)小(xiao)麥(mai)穗(sui)中(zhong)(zhong)提(ti)(ti)取的(de)(de)RNA構建了(le)高(gao)質(zhi)(zhi)量(liang)酵母雙雜(za)交文庫。PFT的(de)(de)凝集素(su)結構域(yu)對(dui)酵母細胞沒有自激活和毒性(xing)(xing)，因(yin)此被(bei)用(yong)作(zuo)誘餌來篩選Y2H文庫。通過(guo)篩庫獲得了(le)與PFT相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)23種蛋白(bai)質(zhi)(zhi)，這(zhe)些(xie)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)主要參與泛素(su)化(hua)過(guo)程，網格蛋白(bai)涂層組(zu)裝，氧(yang)化(hua)還原過(guo)程和蛋白(bai)質(zhi)(zhi)磷酸化(hua)。這(zhe)些(xie)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)基(ji)因(yin)的(de)(de)表達(da)模(mo)式(shi)通過(guo)實時定量(liang)PCR進行了(le)驗證。這(zhe)項研究(jiu)闡(chan)明(ming)了(le)PFT的(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)，并提(ti)(ti)出了(le)有關(guan)(guan)小(xiao)麥(mai)FHB抗性(xing)(xing)的(de)(de)PFT調控網絡。
高度抗(kang)FHB的蘇麥3號（培育條件：光照時間(jian)14h，室溫24℃；黑暗時間(jian)10h，室溫15℃。收集(ji)樣品立(li)即(ji)在(zai)液(ye)氮(dan)中冷凍，然后保(bao)存在(zai)-80°C直至(zhi)進一步使用。）
酵母生長性能的評估：PFT包含兩個結構域，一個是兩個凝集素結構域。另一個是ETX/MTX2蛋白結構域（圖A）。ETX/MTX2蛋白是有效的毒素，對活細胞構成潛在威脅。將全長PFT及其兩個結構域分別轉化到Y2HGold酵母菌株中，然后接種在缺乏亮氨酸（SD/-Leu）培養基上，僅含有凝集素的酵母細胞的生長域沒有被感染，但是與空載體對照相比，ETX/MTX2毒素的表達對酵母菌的生長有毒性作用（圖B）。
誘(you)餌自激(ji)活的檢(jian)測：將載體pGBKT7，pCL1和pGBKT7-PFTa轉化到Y190酵母菌株中，然后將所得轉化體接種在帶色氨酸且含有酵母半乳糖苷酶發色底物（SD/-Leu）的SD培養基上。陽性對照pCL1菌落在SD/-Leu/X-α-Gal平板上變為藍色（圖2B），但與陰性對照一樣，pGBKT7-PFTa菌落也未變為藍色（圖(tu)2A，C），表明誘餌pGBKT7-PFTa在沒有獵物蛋白的情況下不能自主激活報告基因，因此它適合用來構建酵母文庫。
酵母文庫的構建：提取小麥穗的總RNA，并質檢總RNA是否完整、有無降解（圖3A）。為了獲得用于后續文庫構建的高質量cDNA，使用SMART技術（Clontech）合成了cDNA，并在1％瓊脂糖凝膠上通過電泳進行質檢分析（圖3B），使用Chroma Spin-1000色譜柱純化消除小cDNA片段（圖3C），然后轉移至pGADT7載體以構建酵母雙雜文庫。為了確定cDNA文庫插入片段的長度，隨機選擇了16個陽性克隆，并通過PCR擴增鑒定。結果表明插入的片段大小在0.5到2.25 kb之間（圖3D），Y2H庫可用于進一步研究。
PFT相互作用蛋白的(de)篩選：將含有AD文庫和pGBKT7-PFTa的Y190酵母細胞涂布到缺陷型平板上進行第一次篩選，總共生長了212個克隆，分離并測序所有質粒的插入片段，鑒定出57個不同的基因。由于存在假陽性克隆，我們將質粒pGBKT7-PFTa和代表不同基因的57個質粒分別轉化到Y2HGold酵母細胞中。Y2HGold菌株由于自身無法合成His和Ade，所以無法在缺少兩種必需氨基酸的培養基上生長。當誘餌和獵物蛋白相互作用時，GAL4響應并誘導His3和Ade2基因進行表達，使細胞能夠生物合成這兩個氨基酸，并在–His–Ade基本培養基上生長。最后，通過篩選鑒定了代表不同基因的23個陽性克隆（圖4），并使用NCBI數據庫和UniProt數據庫對克隆測序結果進行比對分析，這樣可獲得具體對應的蛋白類型。
文(wen)獻引用：
[1] Stanley Field&Ok-kyu Song, a noval gentic system of detecting protein-protein instractions[J]. Nature, 1989.
[2] Yi He1, LeiWu1, Xiang Liu2,et al.Yeast two-hybrid screening for proteins that interact with PFT in wheat [J]. Scientific Reports. 2019, 9:15521.
