2020-06-29
DNA、RNA和(he)(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)是三種重要的生(sheng)物(wu)大分子，是生(sheng)命現(xian)象的分子基(ji)礎。DNA的遺傳信(xin)息決定生(sheng)命的主(zhu)要性狀，而(er)mRNA在(zai)信(xin)息傳遞中(zhong)起著重要的作用(yong)(yong)。其(qi)他兩(liang)大類RNA，即rRNA和(he)(he)tRNA同(tong)樣(yang)在(zai)蛋(dan)白(bai)質(zhi)的生(sheng)物(wu)合(he)成中(zhong)發揮著不(bu)可替代(dai)的功(gong)能(neng)。因此(ci)RNA在(zai)DNA和(he)(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)中(zhong)間(jian)起著中(zhong)介的作用(yong)(yong)，其(qi)重要性不(bu)言而(er)喻(yu)。
在(zai)(zai)研究RNA的(de)分子(zi)實驗中(zhong)，獲得(de)高(gao)質(zhi)量的(de)RNA至關重要，但是有些樣本因(yin)為細(xi)胞結構特(te)殊、代謝產物極(ji)其(qi)豐富、本身RNA豐度低(di)等因(yin)素，影響(xiang)到RNA提(ti)取(qu)質(zhi)量。另(ling)外，由于RNA酶的(de)廣泛(fan)存(cun)在(zai)(zai)并(bing)難以消減的(de)頑強特(te)性，使得(de)RNA的(de)抽提(ti)純化更為困難。
那么今天我們(men)針對(dui)RNA提取相關知識展開簡短的介紹(shao)~
一(yi)、RNA提取原則
(1) 保證RNA分子(zi)的完整性
(2) 排除DNA分子的(de)污染
(3) 排除有機(ji)溶劑、金屬離子、蛋白質、多糖、多酚、脂類的污染
(4) 獲得足量的核酸
(5)方法(fa)操作簡(jian)便(bian)，穩(wen)定(ding)性強
不(bu)同組(zu)織(zhi)中RNA豐(feng)度示意圖
二、RNA種(zhong)類
有mRNA、rRNA、tRNA、LncRNA、circRNA、miRNA、piRNA、siRNA等
三、RNA提取注意事項
1、操作(zuo)環(huan)境干(gan)凈無灰塵(chen)，嚴格戴好口(kou)罩、手(shou)套等。
2、實驗所涉及的離(li)心管、槍頭(tou)、移(yi)液器、電泳(yong)槽、實驗臺面等要用RNase抑制劑徹(che)底處(chu)理。
3、實驗所涉及的試劑、溶(rong)液，尤其是(shi)水必須確(que)保RNase-Free。
4、選擇合適的勻(yun)漿方法。
5、選擇合適的裂解液(ye)。
6、控制(zhi)好樣品的起始量。
7、控制好裂(lie)解(jie)液與樣品(pin)量(liang)的(de)比例(li)。
8、RNA抽(chou)提成功的唯一經(jing)濟標準是后(hou)續實(shi)驗的一次成功，而不是得率。即綜合RNA的得率和純度(du)。
四、RNA提取原理(li)及常用方法問題
1、 RNA提取原理
RNA提取步驟，大致可分為裂解(jie)(jie)(jie)和純化(hua)(hua)。首先對(dui)樣品裂解(jie)(jie)(jie)，采用機械力、化(hua)(hua)學試劑等方(fang)法(fa)將RNA釋放出(chu)來(lai)，隨后(hou)去除蛋(dan)白質(zhi)、糖(tang)、酚、金屬離子等雜(za)質(zhi)，再用無(wu)水乙醇、異(yi)丙醇沉淀或(huo)載體吸附RNA，之后(hou)洗滌溶解(jie)(jie)(jie)即可得到核酸。
2、RNA提取常用方法
異硫氰酸胍/苯酚法(fa)(fa)（如Trizol法(fa)(fa)）
試劑盒過柱法
磁珠法
改良方(fang)法
3、RNA提取過程(cheng)中(zhong)常見問題
五、幾種難提取樣(yang)本案例
以(yi)上介紹(shao)了(le)RNA提(ti)取中的一(yi)些(xie)小知識(shi)點，那(nei)么接下來我們簡(jian)單列舉幾種特殊樣本的采集要求及提(ti)取結果~
1、全血樣本(ben)
樣本采集：一般是抗凝血與TRIzol LS按體積1:3的比例混勻，立即液氮速凍15min以上，隨后-80℃保存，送樣量不低于3mL。
獨特優勢：實驗(yan)室在原有(you)TRIzol的提取(qu)方法上進行(xing)改良(liang)，提取(qu)的得(de)到的RNA純度(du)和(he)得(de)率較(jiao)正常TRIzol法效果更佳。
結果對比：
2、植(zhi)物樣本
樣本采集：在活體狀態下擦凈組(zu)織(zhi)表(biao)面灰(hui)塵和雜(za)質(zhi)（盡(jin)量(liang)選擇幼嫩組(zu)織(zhi)），隨(sui)后取樣，迅速放入(ru)預冷好(hao)的已(yi)寫好(hao)編號(hao)的RNase-free的螺(luo)紋凍存(cun)管中，立即液氮速凍15min以上，隨(sui)后-80℃保存(cun)。
2.1 淀粉含量高樣(yang)本（比如(ru)：水稻(dao)胚乳）
獨特優勢：公(gong)司擁有發(fa)明專利的CTAB+TRIzol改良(liang)法，能有效(xiao)去除淀粉、得(de)到高純度(du)高質量的RNA。
結(jie)果對比：
2.2 多糖多酚類樣本（比如(ru)：茶葉）
獨特優(you)勢：對(dui)現有試劑(ji)盒進行改良(liang)，加入前處理后(hou)，提(ti)取核酸純度(du)有明顯提(ti)升，利于后(hou)續的建庫(ku)測(ce)序和分(fen)析。
結果對比：
2.3 油脂(zhi)含量高(gao)樣本(ben)（比如：油菜籽）
結果展(zhan)示(shi)：
結果(guo)展示：
圖為干燥的苦蕎(qiao)種子提取檢測結(jie)果
3、動物樣本
樣本采集：快速(su)從動物(wu)活體(ti)取材獲得組(zu)織后，立(li)即用預冷(leng)的(de)(de)RNase-Free 水進行漂洗，以去除血漬和污(wu)物(wu)，迅速(su)將(jiang)組(zu)織放入預冷(leng)的(de)(de)RNase-Free帶螺旋帽(mao)的(de)(de) 2.0 mL的(de)(de)凍存(cun)管中(zhong)，立(li)即液氮(dan)速(su)凍15min以上，隨后-80℃保存(cun)。
3.1 脂肪組織
脂肪(fang)組(zu)(zu)織單(dan)位體積內(nei)細(xi)胞(bao)數少，且單(dan)位細(xi)胞(bao)內(nei)RNA含量(liang)相(xiang)對(dui)較少，這增加了(le)從脂肪(fang)組(zu)(zu)織提取(qu)(qu)RNA的難度，對(dui)于脂肪(fang)組(zu)(zu)織，需要(yao)客(ke)戶加大送樣量(liang)，送樣量(liang)應為常規樣本量(liang)的3-4倍。公(gong)司有專門(men)針對(dui)脂肪(fang)組(zu)(zu)織的提取(qu)(qu)方法，所提取(qu)(qu)得到的RNA純度較高(gao)，完整度好。
結果展示(shi)：
圖為(wei)小鼠脂肪組織提取檢測結果
3.2 軟骨(gu)組(zu)織(zhi)
軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)組織中(zhong)含有(you)大量的(de)水(shui)分和細(xi)(xi)胞外(wai)基質蛋白(bai)，軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)(xi)胞只占整個組織重(zhong)量的(de)3%左右，并且軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)(xi)胞又被大量軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)基質所(suo)包(bao)裹，細(xi)(xi)胞不(bu)易從基質中(zhong)分離出(chu)來，這樣在常規硫氰酸胍法提取中(zhong)相當數量的(de)軟(ruan)(ruan)骨(gu)(gu)細(xi)(xi)胞仍被在基質包(bao)裹中(zhong)，未能(neng)從基質中(zhong)分離出(chu)來，由此造成RNA得(de)率很低；另(ling)外(wai)基質糖(tang)蛋白(bai)與RNA會(hui)形成共沉淀(dian)，使(shi)RNA難以被進一(yi)步純化。目前公司在現有(you)試劑盒(he)的(de)方(fang)法上進行改良(liang)，增加(jia)前處理，得(de)到(dao)的(de)RNA純度和總量能(neng)滿(man)足(zu)后(hou)續的(de)常規建(jian)庫需(xu)要。
結果展示：
圖中為雞軟(ruan)骨組織提取檢測結果
