2020-06-30
三十而立(li)，在短短的三十幾年里(li)，經歷從(cong)(cong)無(wu)到有，從(cong)(cong)質疑(yi)到認可，從(cong)(cong)寂(ji)寂(ji)無(wu)名到炙(zhi)手可熱，CRISPR-Cas技術(shu)可以(yi)說是目(mu)前生命科學(xue)領域發展迅速的技術(shu)了。
它究竟(jing)是怎么(me)回(hui)事？
是怎么一步(bu)一步(bu)發展起來的？
為什么(me)這么(me)火(huo)？到底怎么(me)用呢？
今天(tian)小編就(jiu)給大家(jia)簡單(dan)的科(ke)普一(yi)下。
圖1 歷(li)年CRISPR相關(guan)文(wen)獻統計
基(ji)(ji)因編輯技(ji)術(shu)是(shi)一(yi)種能(neng)夠對(dui)(dui)生物體的(de)(de)基(ji)(ji)因組及轉錄產物進行定點修(xiu)飾或者(zhe)修(xiu)改的(de)(de)技(ji)術(shu)，早(zao)期基(ji)(ji)因編輯技(ji)術(shu)包括歸巢內切酶(mei)(homing endonuclease, HEs)、鋅指核酸(suan)(suan)內切酶(mei)（zinc finger endonuclease, ZFN）和類轉錄激活因子(zi)效應(ying)物(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)，但脫靶(ba)(ba)效應(ying)和組裝復雜(za)性(xing)限制(zhi)了這(zhe)些(xie)技(ji)術(shu)在(zai)基(ji)(ji)因編輯領域的(de)(de)應(ying)用。CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)系統(tong)最(zui)初(chu)在(zai)大腸(chang)桿菌基(ji)(ji)因組中被發現，是(shi)細菌中抵抗外源(yuan)病毒(du)的(de)(de)免疫系統(tong)。CRISPR-Cas9系統(tong)由兩部(bu)分組成(cheng)，一(yi)部(bu)分是(shi)用來識別靶(ba)(ba)基(ji)(ji)因組，長度為20bp左右的(de)(de)sgRNA序列，另外一(yi)部(bu)分是(shi)存在(zai)于CRISPR位(wei)點附近的(de)(de)雙鏈(lian)DNA核酸(suan)(suan)酶(mei)——Cas9，能(neng)在(zai)sgRNA的(de)(de)引導下對(dui)(dui)靶(ba)(ba)位(wei)點進行切割，最(zui)終通(tong)過(guo)細胞(bao)內的(de)(de)非同源(yuan)性(xing)末端連接機制(zhi)（NHEJ）和同源(yuan)重組修(xiu)復機制(zhi)（HDR）對(dui)(dui)形成(cheng)斷裂的(de)(de)DNA進行修(xiu)復，從(cong)而(er)形成(cheng)基(ji)(ji)因的(de)(de)敲除和插入，最(zui)終實現基(ji)(ji)因的(de)(de)（定向）編輯。
與(yu)前兩代技(ji)術(shu)相比，憑借(jie)著成本(ben)低廉，操作(zuo)方(fang)便，效(xiao)率高(gao)等優點，CRISPR/Cas9迅速(su)風靡全球(qiu)的實驗室(shi)，成為(wei)(wei)了生物科研的有力幫手(shou)。CRISPR-Cas9技(ji)術(shu)最(zui)大的突破(po)是(shi)不僅可(ke)(ke)以對(dui)單個(ge)(ge)基(ji)因進行編輯(ji)，更重要的是(shi)可(ke)(ke)以同時對(dui)多個(ge)(ge)基(ji)因進行編輯(ji)，這也為(wei)(wei)全基(ji)因組篩選提供(gong)了有效(xiao)的方(fang)法。
CRISPR簇(cu)是(shi)一(yi)個(ge)廣泛存在(zai)于細(xi)菌(jun)和(he)古生菌(jun)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)中的(de)(de)(de)特(te)殊DNA重(zhong)復(fu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)家族(zu)，充當了防御外源(yuan)遺傳(chuan)(chuan)物(wu)質的(de)(de)(de)“基(ji)(ji)因(yin)(yin)武器”。CRISPR是(shi)—成(cheng)簇(cu)的(de)(de)(de)規律(lv)間隔(ge)(ge)的(de)(de)(de)短(duan)(duan)回文(wen)重(zhong)復(fu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)，分布在(zai)40%的(de)(de)(de)已(yi)測(ce)序(xu)(xu)(xu)細(xi)菌(jun)和(he)90%的(de)(de)(de)已(yi)測(ce)序(xu)(xu)(xu)古菌(jun)當中。圖2展示了完整的(de)(de)(de)CRISPR位點的(de)(de)(de)結構(gou)。其(qi)中，CRISPR序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)由眾多短(duan)(duan)而保守的(de)(de)(de)重(zhong)復(fu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)區(qu)(qu)(qu)(qu)（repeat）和(he)間隔(ge)(ge)區(qu)(qu)(qu)(qu)（spacer）組(zu)成(cheng)。重(zhong)復(fu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)區(qu)(qu)(qu)(qu)含有(you)回文(wen)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)，可(ke)以形(xing)成(cheng)發卡結構(gou)。而間隔(ge)(ge)區(qu)(qu)(qu)(qu)比較特(te)殊，它們(men)是(shi)被(bei)細(xi)菌(jun)俘獲(huo)的(de)(de)(de)外源(yuan)DNA序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)。這就(jiu)相當于細(xi)菌(jun)免疫系(xi)統(tong)的(de)(de)(de)“黑(hei)名單”，當這些(xie)外源(yuan)遺傳(chuan)(chuan)物(wu)質再次入侵時，CRISPR/Cas系(xi)統(tong)就(jiu)會予以精確打擊。而在(zai)上游的(de)(de)(de)前導區(qu)(qu)(qu)(qu)（leader）被(bei)認為是(shi)CRISPR序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)的(de)(de)(de)啟動子。另(ling)外，在(zai)上游還有(you)一(yi)個(ge)多態性的(de)(de)(de)家族(zu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，該基(ji)(ji)因(yin)(yin)編碼的(de)(de)(de)蛋(dan)白均可(ke)與CRISPR序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)區(qu)(qu)(qu)(qu)域共(gong)(gong)同(tong)發生作用。因(yin)(yin)此，該基(ji)(ji)因(yin)(yin)被(bei)命名為CRISPR關聯基(ji)(ji)因(yin)(yin)（CRISPR associated，Cas）。目前已(yi)經發現了Cas1-Cas13等多種類(lei)型的(de)(de)(de)Cas基(ji)(ji)因(yin)(yin)。Cas基(ji)(ji)因(yin)(yin)與CRISPR序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)共(gong)(gong)同(tong)進化(hua)，形(xing)成(cheng)了在(zai)細(xi)菌(jun)中高度保守的(de)(de)(de)CRISPR/Cas系(xi)統(tong)。
圖(tu)2 CRISPR位點(dian)結構圖(tu)
CRISPR/Cas9系統(tong)的工(gong)作原(yuan)理(li)可(ke)以(yi)概括為以(yi)下(xia)幾步：
1、外源DNA俘獲并添加到(dao)基(ji)因組的CRISPR序列之中。
2、CRISPR座(zuo)位(wei)轉錄形成前體crRNA(crisprRNA)；
3、Pre-crRNA經過剪接形成成熟的(de)crRNA；
4、crRNA、tracrRNA與Cas蛋白結(jie)合(he)，引導Cas蛋白到達(da)目(mu)標(biao)區域；
5、Cas蛋(dan)白(bai)剪切目(mu)標片段，形成雙鏈斷裂（DSB）；
6、細胞的(de)修(xiu)復機制啟動(dong)，修(xiu)復DNA，引入突變。
圖3 CRISPR工作原理圖
當(dang)sgRNA靶向單(dan)基(ji)因(yin)(yin)時，CRISPR可(ke)視(shi)為一(yi)種高效的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)編輯工具。但(dan)當(dang)sgRNA靶向全基(ji)因(yin)(yin)組序列時，CRISPR便升級為一(yi)種全基(ji)因(yin)(yin)組篩選(xuan)的(de)(de)工具。基(ji)于CRISPR/Cas9篩選(xuan)的(de)(de)一(yi)般流程如下（圖4）：
1、構建靶向全基(ji)因(yin)組(zu)的基(ji)因(yin)敲除文庫(ku)(genome-scale CRISPR-Cas9 knockout, GeCKO)或激活基(ji)因(yin)sgRNA文庫(ku)；
2、包裝慢病毒文(wen)庫；
3、以低MOI感(gan)染細胞，使sgRNA整合到細胞基因組上，隨基因組DNA的復制而復制；
4、用(yong)抗生素篩選出(chu)感染(ran)病(bing)毒的(de)細胞(bao)；
5、根據表型(xing)(耐藥性、增殖能力、存(cun)活能力、標記基因等)選(xuan)擇細(xi)胞(bao)；
6、提取細胞核基(ji)因組；
7、建庫，進行二代測序；
8、利用(yong)生物(wu)信息(xi)學分析獲得目的基因(yin)。
圖(tu)4 sgRNA文庫篩選流程(cheng)圖(tu)
1、藥物靶點確(que)定與驗證(zheng)
CRISPR-Cas9篩選(xuan)技術(shu)(shu)可以(yi)應用于藥物靶點篩選(xuan)中，通過大規模篩選(xuan)技術(shu)(shu)，可以(yi)系統的分(fen)析、驗證一些(xie)與抗藥性(xing)相關(guan)的基因(yin)，從而為疾病治療提供相關(guan)數據。美國(guo)加州大學圣地亞(ya)哥分(fen)校的研(yan)究(jiu)人(ren)員(yuan)在(zai)國(guo)際頂尖(jian)學術(shu)(shu)期刊Nature子刊Nature Cancer期刊上發表(biao)的題(ti)為“An in vivo genome-wide CRISPR screen identifies the RNA-binding protein Staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia”的研(yan)究(jiu)論文，研(yan)究(jiu)人(ren)員(yuan)使用CRISPR技術(shu)(shu)在(zai)白(bai)血病細胞中進行全基因(yin)組篩選(xuan)，并識別出了侵襲性(xing)慢性(xing)髓(sui)系白(bai)血病的關(guan)鍵調節因(yin)子——Staufen2，該分(fen)子或可成為治療慢粒(li)白(bai)血病的新靶點。
2、基因環路上下游(you)調控機制分(fen)析
CRISPR-Cas9文庫篩選技術不僅可(ke)以(yi)用(yong)于(yu)編輯人類細胞蛋(dan)白(bai)編碼基因(yin)(yin)，對于(yu)基因(yin)(yin)組中的(de)調(diao)(diao)控元件也(ye)同(tong)樣有效，利用(yong)這種方法(fa)可(ke)以(yi)對基因(yin)(yin)環路上游有調(diao)(diao)控機制(zhi)進行分析(xi)。在Nature上發表題為(wei)“CRISPR screen in regulatory T cells reveals modulators of Foxp3”的(de)文章(zhang)，通過在小鼠Treg細胞中進行CRISPR篩選，發現了新的(de)影(ying)響Treg中Foxp3蛋(dan)白(bai)穩(wen)定性(xing)的(de)調(diao)(diao)控因(yin)(yin)子(zi)Usp22和Rnf20，并闡述了其中機制(zhi)。
3、代謝通路調節(jie)機制(zhi)分析
CRISPR-Cas9技術(shu)在人體代(dai)謝(xie)調控中(zhong)也有相關成果。來自(zi)美國(guo)哈佛(fo)大學醫學院(yuan)、霍華(hua)德休斯醫學研(yan)究所(suo)、Broad研(yan)究所(suo)及(ji)(ji)麻(ma)省總醫院(yuan)Vamsi Mootha實驗室的研(yan)究人員在Cell雜志(zhi)上在線發表了題為“Genetic screen for Cell Fitness in High or Low Oxygen Highlights Mitochondrial and Lipid Metabolism”的研(yan)究論文，通(tong)(tong)過CRISPR篩選技術(shu)，系統(tong)鑒定了人體基因和通(tong)(tong)路(lu)水平(ping)對高低(di)氧(yang)環境(即21%、5%及(ji)(ji)1%O2)的細(xi)胞(bao)健(jian)康(kang)(cell fitness)水平(ping)的變化，揭(jie)示了參與氧(yang)感受、代(dai)謝(xie)的基因及(ji)(ji)通(tong)(tong)路(lu)。
4、Long noncoding RNA作(zuo)用機制分析
CRISPR-Cas9文庫的(de)建(jian)立可(ke)以實現(xian)基(ji)因(yin)(yin)組的(de)大規模篩(shai)選，為了(le)對(dui)非編(bian)碼基(ji)因(yin)(yin)的(de)功能(neng)進(jin)行驗(yan)證(zheng)，Nature biotechnology發表文章“Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library”提出構(gou)建(jian)了(le)psgRNAs文庫的(de)方(fang)法(fa)，這種成對(dui)的(de)sgRNA可(ke)在同一基(ji)因(yin)(yin)中造(zao)成兩處斷裂，形(xing)成大片段缺失(shi)，從而(er)影響表型變化，成為研究非編(bian)碼基(ji)因(yin)(yin)的(de)重要方(fang)法(fa)。使用慢病毒(du)psgRNA文庫，對(dui)人源肝癌(ai)細(xi)胞系Huh7.5OC進(jin)行基(ji)因(yin)(yin)組的(de)700個lncRNA和另(ling)外5種癌(ai)癥細(xi)胞進(jin)行敲除實驗(yan)，最終篩(shai)選到(dao)51個lncRNA基(ji)因(yin)(yin)能(neng)夠促進(jin)或(huo)者抑制腫瘤的(de)生長。
介紹到這里(li)，大家是(shi)不(bu)是(shi)已經折服于CRISPR的巨大魅力和無限(xian)潛(qian)力了呢(ni)？是(shi)不(bu)是(shi)感覺高分文章在向(xiang)您(nin)招(zhao)手呢(ni)？
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