2020-07-06
烈日炎(yan)炎(yan)，暑期將至，空調可以抵(di)御(yu)高溫的(de)折磨，卻抵(di)擋(dang)不住派森諾眾(zhong)位客戶的(de)熱情。目前(qian)派森諾轉錄(lu)組(zu)(zu)測序產品中，真(zhen)(zhen)(zhen)核(he)(he)生物(wu)mRNA文(wen)庫(ku)構建的(de)方式(shi)有兩(liang)種，分別是真(zhen)(zhen)(zhen)核(he)(he)非鏈特(te)(te)異(yi)性(xing)(xing)轉錄(lu)組(zu)(zu)文(wen)庫(ku)（又稱普通轉錄(lu)組(zu)(zu)文(wen)庫(ku)）和真(zhen)(zhen)(zhen)核(he)(he)鏈特(te)(te)異(yi)性(xing)(xing)轉錄(lu)組(zu)(zu)文(wen)庫(ku)，隨著(zhu)轉錄(lu)組(zu)(zu)研(yan)究(jiu)的(de)不斷深(shen)入，真(zhen)(zhen)(zhen)核(he)(he)鏈特(te)(te)異(yi)性(xing)(xing)轉錄(lu)組(zu)(zu)文(wen)庫(ku)越(yue)來越(yue)受到大(da)家(jia)的(de)青睞。那么(me)問題來了，什(shen)么(me)是“鏈(lian)特(te)異(yi)”？為什(shen)么(me)選擇(ze)“鏈(lian)特(te)異(yi)”？何時選擇(ze)“鏈(lian)特(te)異(yi)”？
今天(tian)小編就(jiu)帶領大家一(yi)(yi)起細數(shu)一(yi)(yi)下“鏈特異”與(yu)“非鏈特異”文(wen)庫的那些事，相(xiang)信看(kan)完你就(jiu)能找到答案。
01、什么(me)是鏈特異性轉錄(lu)組測序？
鏈(lian)特異性轉(zhuan)錄(lu)組測序(xu)(xu)（strand-specific RNA-seq）是指在構(gou)建測序(xu)(xu)文庫時，將(jiang)轉(zhuan)錄(lu)本(ben)的方向信息(xi)保存到測序(xu)(xu)文庫中，測序(xu)(xu)后的數據分析可(ke)(ke)確定轉(zhuan)錄(lu)本(ben)是來(lai)源于基(ji)因(yin)(yin)組的正鏈(lian)或負鏈(lian)。與普通轉(zhuan)錄(lu)組測序(xu)(xu)相比，它更能(neng)準確地統計轉(zhuan)錄(lu)本(ben)的數量和(he)確定基(ji)因(yin)(yin)的結(jie)構(gou)，同時可(ke)(ke)以發(fa)(fa)現更多(duo)的反(fan)義轉(zhuan)錄(lu)本(ben)，而(er)這些(xie)反(fan)義轉(zhuan)錄(lu)本(ben)對(dui)基(ji)因(yin)(yin)的表達調控可(ke)(ke)能(neng)起非常重要(yao)的作用，此外還可(ke)(ke)能(neng)發(fa)(fa)現新的基(ji)因(yin)(yin)，對(dui)研究基(ji)因(yin)(yin)結(jie)構(gou)和(he)基(ji)因(yin)(yin)表達調控都具有重要(yao)意義。
02、普通轉錄組文庫和“鏈特異”文庫區別(bie)
眾(zhong)所周知，DNA是(shi)雙螺旋結構且具有(you)正(zheng)負鏈(lian)之(zhi)分(fen)，通(tong)常將攜帶有(you)編(bian)碼蛋白質(zhi)氨基酸信息(xi)的(de)核苷酸序列(lie)的(de)鏈(lian)稱(cheng)為正(zheng)義(yi)鏈(lian)，另一條(tiao)(tiao)鏈(lian)核苷酸序列(lie)與(yu)正(zheng)義(yi)鏈(lian)互補，稱(cheng)為反義(yi)鏈(lian)。簡單來講(jiang)，“鏈(lian)特(te)異”文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)是(shi)以(yi)RNA反轉錄的(de)cDNA一條(tiao)(tiao)鏈(lian)為模板進(jin)行PCR擴(kuo)增構建(jian)的(de)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)，而普(pu)通(tong)轉錄組文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)是(shi)以(yi)RNA反轉錄的(de)cDNA兩(liang)條(tiao)(tiao)鏈(lian)為模板進(jin)行PCR擴(kuo)增構建(jian)的(de)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)。因此，普(pu)通(tong)轉錄組文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)無法(fa)區分(fen)RNA極性，而“鏈(lian)特(te)異”文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)能夠有(you)效區分(fen)RNA極性，這就是(shi)兩(liang)種文(wen)(wen)(wen)庫(ku)(ku)的(de)區別(bie)所在(zai)。
03、如(ru)何實現“鏈特異”建(jian)庫(ku)？
與(yu)傳統普通(tong)轉錄(lu)(lu)組建庫(ku)(ku)相(xiang)比，“鏈(lian)(lian)(lian)(lian)特異(yi)(yi)”建庫(ku)(ku)在實驗原理(li)和操(cao)作步驟上(shang)又有何差異(yi)(yi)呢？目前(qian)，市面上(shang)“鏈(lian)(lian)(lian)(lian)特異(yi)(yi)”建庫(ku)(ku)方法(fa)有多(duo)種，而小編使(shi)用的(de)是(shi)最普遍的(de)dUTP法(fa)，即在合成cDNA第二鏈(lian)(lian)(lian)(lian)時用dUTP代替dTTP，然后在PCR富集之(zhi)前(qian)使(shi)用UDG將(jiang)含有U的(de)DNA鏈(lian)(lian)(lian)(lian)水解掉，這樣就只(zhi)有第一鏈(lian)(lian)(lian)(lian)保留下來，即可知道測序得到的(de)轉錄(lu)(lu)本(ben)是(shi)來自(zi)于(yu)正(zheng)義(yi)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)還是(shi)反義(yi)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)。話不多(duo)說，直接上(shang)圖比較(jiao)一下普通(tong)轉錄(lu)(lu)組建庫(ku)(ku)和鏈(lian)(lian)(lian)(lian)特異(yi)(yi)建庫(ku)(ku)的(de)流(liu)程差異(yi)(yi)：
PS、課(ke)外知識
dUTP法
又稱摻(chan)U法，首先使用常(chang)規的(de)(de)方(fang)法從RNA上(shang)逆轉(zhuan)錄出第一條cDNA鏈，然(ran)后在(zai)合(he)成第二條cDNA鏈時，將加入(ru)的(de)(de)dNTPs中的(de)(de)dTTP替(ti)換為dUTP，使得合(he)成出的(de)(de)第二條cDNA鏈中會摻(chan)入(ru)大量(liang)U堿(jian)(jian)基，隨后在(zai)雙鏈cDNA的(de)(de)兩頭接(jie)上(shang)接(jie)頭，最后在(zai)PCR擴增階段使用UDG酶特異性降解帶有U堿(jian)(jian)基的(de)(de)cDNA鏈，從而保證(zheng)得到的(de)(de)轉(zhuan)錄組文庫保留其方(fang)向性。
UDG
尿嘧啶(ding)-DNA糖基(ji)(ji)(ji)化(hua)酶：Uracil-DNA Glycosylase，簡稱UDG，能夠特異識別DNA鏈(lian)中(zhong)的(de)尿嘧啶(ding)堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)(ji)（U），并(bing)且把U堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)(ji)進行糖基(ji)(ji)(ji)化(hua)，隨后將糖基(ji)(ji)(ji)化(hua)的(de)U堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)(ji)從核(he)酸(suan)鏈(lian)上切除，使(shi)核(he)酸(suan)鏈(lian)上就(jiu)生成一個(ge)缺(que)堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)(ji)的(de)空位，然后在脫堿(jian)(jian)(jian)基(ji)(ji)(ji)位點上降解核(he)酸(suan)鏈(lian)，使(shi)得DNA不(bu)能再被DNA聚合酶復制，對RNA無活性，常被用(yong)于(yu)消除PCR擴增中(zhong)的(de)參與污染。
04、為何選擇“鏈特異”文庫？
從上面二者的(de)(de)(de)操(cao)作步(bu)驟可(ke)以(yi)(yi)得(de)知，普(pu)通轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)建庫無法確定RNA的(de)(de)(de)方(fang)(fang)向性(xing)，對于(yu)(yu)反義轉(zhuan)(zhuan)錄本(ben)(ben)的(de)(de)(de)發現、新(xin)基(ji)因(yin)功能注釋、基(ji)因(yin)結構分(fen)析及基(ji)因(yin)表達(da)的(de)(de)(de)精確計算均具(ju)有很大的(de)(de)(de)限(xian)制(zhi)，而“鏈(lian)特(te)(te)異”建庫可(ke)以(yi)(yi)保留RNA的(de)(de)(de)方(fang)(fang)向性(xing)，測(ce)序時可(ke)以(yi)(yi)確定轉(zhuan)(zhuan)錄本(ben)(ben)來(lai)源于(yu)(yu)基(ji)因(yin)組(zu)的(de)(de)(de)正義鏈(lian)或反義鏈(lian)，能夠(gou)很好的(de)(de)(de)克服(fu)普(pu)通轉(zhuan)(zhuan)錄組(zu)測(ce)序的(de)(de)(de)不足，基(ji)于(yu)(yu)此，鏈(lian)特(te)(te)異性(xing)建庫具(ju)有比傳統(tong)建庫更多(duo)優勢，包括：
（1）定量轉錄本表達量更精確
由(you)于“鏈特異”文庫可以(yi)保留RNA的方向信息，因(yin)此在計算某些轉(zhuan)錄本(ben)的表達量時，可以(yi)排除來(lai)自(zi)其(qi)互補鏈上的轉(zhuan)錄本(ben)表達的干(gan)擾，使(shi)得基因(yin)定量更精(jing)準。
（2）可變剪切事件檢(jian)測(ce)更準確
鏈特異(yi)性文庫可(ke)以排除反(fan)義鏈上轉(zhuan)錄本的影響，使可(ke)變(bian)剪接事件的假陽(yang)性率降低。已知circRNA由反(fan)向剪切形成，在(zai)發掘(jue)新的circRNA時(shi)，鏈特異(yi)性的測(ce)序(xu)方式有助于(yu)提(ti)高circRNA檢(jian)測(ce)的準確率。
（3）提高(gao)非(fei)編(bian)碼(ma)轉(zhuan)錄本的檢(jian)出率，發掘潛在順式天然反義轉(zhuan)錄本
反義轉錄(lu)廣泛存在于真核生物(wu)中，且在發育、代謝(xie)等多種生物(wu)學過程中具有非(fei)(fei)常重要的(de)(de)調控作(zuo)用。鏈特異性(xing)文(wen)庫可以提高(gao)反義鏈上非(fei)(fei)編(bian)碼(ma)轉錄(lu)本的(de)(de)檢出(chu)率，同時也(ye)便于確(que)定哪些位于基因間的(de)(de)非(fei)(fei)編(bian)碼(ma)轉錄(lu)本的(de)(de)方向。
（4）更好預測原生(sheng)生(sheng)物操縱(zong)子（operon）
原核生物的(de)基(ji)因(yin)(yin)為多(duo)順(shun)反子(zi)結構(gou)，如果對(dui)正反義轉錄本上的(de)基(ji)因(yin)(yin)不加區分(fen)，那么對(dui)應位(wei)置的(de)基(ji)因(yin)(yin)表達(da)量會計(ji)算不準確，對(dui)操(cao)縱子(zi)以及基(ji)因(yin)(yin)結構(gou)的(de)預測也更不準確。“鏈特異”文庫(ku)可更準確實現對(dui)操(cao)縱子(zi)鑒定(ding)與分(fen)析。
（5）轉錄本組裝更(geng)高效、真實
普通轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)組(zu)組(zu)裝(zhuang)出來的unigene既(ji)包(bao)括編碼轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本，也包(bao)括一些非編碼轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本（如lncRNA），若(ruo)不(bu)區分正(zheng)反鏈，那(nei)么有(you)互補(bu)配對關系的編碼與(yu)非編碼轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本會被組(zu)裝(zhuang)成(cheng)一條轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本，所以“鏈特異”文庫可明確(que)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本的方向(xiang)性，在進行無參轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)(lu)本組(zu)裝(zhuang)時顯得很有(you)必(bi)要。
05、何時選擇(ze)“鏈特異”文庫？
說(shuo)了(le)那么(me)多，相信大(da)家對鏈特(te)異性(xing)文庫已經有(you)了(le)系統的(de)(de)了(le)解，既然鏈特(te)異性(xing)文庫有(you)這(zhe)么(me)多好(hao)處(chu)，那么(me)該(gai)何時將(jiang)這(zhe)些好(hao)處(chu)加以(yi)(yi)具體(ti)應用呢(ni)？為了(le)更好(hao)地(di)促進(jin)您(nin)的(de)(de)轉錄組(zu)研究，貼心(xin)的(de)(de)小(xiao)編為大(da)家整(zheng)理了(le)“鏈特(te)異”文庫應用方(fang)向的(de)(de)思路參考，若您(nin)的(de)(de)轉錄組(zu)研究涉及到以(yi)(yi)下幾個方(fang)向（包括但不限于）：
（1）差異基因精準分析；
（2）原(yuan)核生物操縱子(zi)分(fen)析；
（3）模式生物結(jie)構分析。
不妨果斷選擇派森(sen)諾(nuo)真核鏈特異性(xing)文(wen)庫，其優越的(de)性(xing)能(neng)和廣泛的(de)應用定將不負(fu)所望！
