2020-07-14
背(bei)景介紹
人類基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)圖譜(pu)及(ji)其初步(bu)分析(xi)結果的報道,以(yi)及(ji)多種模式生物、重要(yao)生物基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)全序列的完成(cheng),標志著結構基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)學(xue)的研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)已取(qu)得重大進展。隨(sui)之而來(lai)，生命科(ke)學(xue)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)進入所謂的“后(hou)基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)時代”。一個以(yi)揭示基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)的功(gong)(gong)能及(ji)調控機制為目(mu)標的功(gong)(gong)能基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)學(xue)的研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)將是今(jin)后(hou)幾(ji)代科(ke)學(xue)家不懈奮斗的目(mu)標。功(gong)(gong)能基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)學(xue)的研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)是21世紀國際研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)前沿之一，也是最熱門的研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)(jiu)領(ling)域之一。
功(gong)能(neng)基(ji)因(yin)組學(xue)(xue)是基(ji)于基(ji)因(yin)組序(xu)列信息，利用各種組學(xue)(xue)技術，在系(xi)(xi)統水(shui)平(ping)上將(jiang)基(ji)因(yin)組序(xu)列與基(ji)因(yin)功(gong)能(neng)(包括(kuo)基(ji)因(yin)網絡)以及表型(xing)有(you)機聯(lian)系(xi)(xi)起來(lai)，最終揭(jie)示(shi)自(zi)然界中生物系(xi)(xi)統不(bu)同(tong)水(shui)平(ping)的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)的(de)(de)(de)科學(xue)(xue)。前人在實驗(yan)手(shou)段及技術方(fang)面做了大量(liang)的(de)(de)(de)研究就探索(suo)，用于確定一(yi)個基(ji)因(yin)有(you)什(shen)(shen)么功(gong)能(neng)，為什(shen)(shen)么這個基(ji)因(yin)有(you)這樣的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)，影響同(tong)一(yi)性狀的(de)(de)(de)不(bu)同(tong)基(ji)因(yin)之間(jian)有(you)沒有(you)什(shen)(shen)么聯(lian)系(xi)(xi)……今天小編(bian)就帶大家(jia)一(yi)起來(lai)了解下其(qi)中一(yi)項常用的(de)(de)(de)驗(yan)證手(shou)段-酵(jiao)母雙(shuang)雜交技術。
研究方法(fa)
1、實驗材料
兩個(ge)煙(yan)草品種的不育（CMS）系和保持系：
（1）yunyan85的保持系(xi)（YY85）及其不育系(xi)（sYY85)；
（2）zhongyan90的保持(chi)系（ZY90）及(ji)其的不育系（sZY90）。
2、研究思路
煙草屬于茄科，目前，茄科的線粒體基因組數據大多為二代測序數據，缺少第三代測序數據，且植物線粒體基因組的結構非常復雜，需要第三代測序技術，以獲得更加優質的基因序列。而正常線粒體基因組和不育線粒體基因組之間的比較分析將有助于研究不育機理，并篩選造成植物不育的相關基因。
因(yin)此(ci)本(ben)研究分(fen)為兩個(ge)部分(fen)，首先是(shi)使(shi)用PacBio和IlluminaHiseq技(ji)(ji)術對兩個(ge)煙草品(pin)種（YY85，sYY85，ZY90和sZY90）的(de)(de)(de)(de)不(bu)(bu)育(yu)系和保持系的(de)(de)(de)(de)花蕾的(de)(de)(de)(de)線(xian)粒(li)體基因(yin)組(zu)進行了測序(xu)，并通過基因(yin)組(zu)de novo測序(xu)的(de)(de)(de)(de)比(bi)較分(fen)析獲得(de)一些(xie)與(yu)(yu)不(bu)(bu)育(yu)相關(guan)的(de)(de)(de)(de)候選(xuan)基因(yin)，然后使(shi)用酵(jiao)母雙雜交技(ji)(ji)術進一步驗(yan)證了參與(yu)(yu)不(bu)(bu)育(yu)機制調(diao)控(kong)的(de)(de)(de)(de)相關(guan)蛋白(bai)之間(jian)相互作用強度(du)的(de)(de)(de)(de)差異。
研究結果
1、線粒體基因(yin)組(zu)特征和基因(yin)含量的比較(jiao)分析
比較了YY85，sYY85，ZY90和sZY90的線粒體基因組特征。不育系的基因組顯著大于其相應保持系的基因組，比后者擴展了約30–60kb。雙鏈斷裂（DSB）修復可能發生在編碼DNA或非編碼DNA上，二者分別是準確的和不準確的。大多數DNA修復是通過DSB的產生來介導的，非編碼序列中不正確的修復性能往往會引入非同源序列。這使得非編碼DNA進化很快，以至于植物線粒體基因組經歷了重大的重排和擴展。
四條線粒體基因組序列的對比分(fen)析
在(zai)(zai)四個線粒(li)體(ti)(ti)基(ji)因(yin)組中(zhong)共發現30個保守的(de)編碼基(ji)因(yin)。atp9，nad3，sdh3，cob，rpl5，rps14和(he)mat-R，以及(ji)ccmC，rpl2和(he)atp4的(de)存在(zai)(zai)均顯(xian)示(shi)了保守編碼基(ji)因(yin)的(de)差異。值得注意(yi)的(de)是，在(zai)(zai)YY85和(he)ZY90中(zhong)都有(you)另一個nad3（nad3-D2）拷貝(bei)。減少的(de)nad3拷貝(bei)數可能(neng)(neng)(neng)會導致(zhi)該基(ji)因(yin)在(zai)(zai)sYY85和(he)sZY90中(zhong)的(de)表達下降，這可能(neng)(neng)(neng)會進(jin)一步(bu)減少線粒(li)體(ti)(ti)能(neng)(neng)(neng)量供應和(he)無功能(neng)(neng)(neng)的(de)花粉生產(chan)。
四個線粒(li)體基因中的(de)保守基因
2、保持系和不育系中(zhong)線粒體基(ji)因(yin)組(zu)結(jie)構的(de)重排
根據四個(ge)線粒(li)體(ti)基(ji)因組的(de)同(tong)(tong)源序(xu)列和同(tong)(tong)義(yi)分析，分別在YY85，sYY85，ZY90和sZY90中發現了45、52、25和27個(ge)同(tong)(tong)源序(xu)列區(qu)域(yu)(yu)（同(tong)(tong)義(yi)嵌(qian)(qian)(qian)段(duan)(duan)(duan)）。在YY85/sYY85和ZY90/sZY90的(de)同(tong)(tong)線區(qu)域(yu)(yu)中，有(you)11個(ge)和9個(ge)共線性區(qu)域(yu)(yu)，24個(ge)和13個(ge)易位區(qu)域(yu)(yu)，3個(ge)和1個(ge)反(fan)向區(qu)域(yu)(yu)以及14和4個(ge)同(tong)(tong)時的(de)反(fan)向和易位區(qu)域(yu)(yu)。在兩(liang)個(ge)煙(yan)草品種的(de)不育系(xi)和保持系(xi)中，超過60％的(de)同(tong)(tong)義(yi)嵌(qian)(qian)(qian)段(duan)(duan)(duan)被重(zhong)排，并且線粒(li)體(ti)基(ji)因組之間的(de)同(tong)(tong)義(yi)嵌(qian)(qian)(qian)段(duan)(duan)(duan)順序(xu)存(cun)在顯著差(cha)異。
具體如下圖所示：
線粒體基(ji)因平行關(guan)聯圖
（橙色(se)是正向(xiang)鏈，藍色(se)是反向(xiang)鏈，方框中(zhong)顏色(se)深度表(biao)示相(xiang)似，完全填充(chong)表(biao)示100%相(xiang)似）
3、煙草(cao)中(zhong)與不(bu)育相(xiang)關的候選基因(yin)
在煙草中，在煙草屬內的各品種之間或煙草與茄科的其他屬之間產生了同質系以及原生質體融合，以獲得用于育種和遺傳研究的不育系。線粒體基因組的重排可能會產生新的嵌合ORF。大多數鑒定出的與CMS相關的基因是許多作物物種中的嵌合ORF，它們與編碼ATP合酶或細胞色素C氧化酶亞基（例如atp6和cox2）的基因融合。但是，尚未在煙草線粒體基因組中發現與CMS相關的嵌合ORF。這種現象表明，煙草中與CMS相關的基因與其他植物中的不同。在此次研究中，在兩個煙草品種的兩個CMS系中都鑒定出了特定的蛋白質編碼基因和ORF，它們被認為是煙草中與CMS相關的候選基因。
4、候選(xuan)不(bu)育系相關基因atp6的蛋白互作驗證（PPI）實驗
根據以前的研究，對于所有候選CMS相關基因，ATP6和CMS之間的關系至關重要。尚未在煙草線粒體基因組中發現與CMS相關的嵌合ORF，因此擬南芥被選作PPI預測的相關物種。ATPase序列的比對結果表明，煙草與擬南芥的相似度超過70％。因此，推測該軟件預測的擬南芥的PPI結果可以更好地反映煙草的PPI趨勢。在預測所有ATPase蛋白的PPI后，結果清楚地表明ATP9可能與ATP6相互作用。因此，使用酵母雙雜交技術選擇了ATP6和ATP9來驗證保持系和CMS系之間潛在的PPI關系差異。結果表明，保持系（圖C）中ATP6和ATP9的PPI弱于CMS系（圖B）。PPI強度的這種差異表明ATP6基因可能是關鍵基因之一，并且是與植物不育相關的重要因素。在未來的研究中，CMS相關的差異將突出ATP6，并進一步擴展到整個線粒體基因組，以發現更多可能在不育中發揮關鍵作用的關鍵基因。煙草線粒體基因組的全面研究有助于增進我們對茄科作物不育機理的了解。
ATP6-ATP9酵母(mu)雙雜驗證圖(tu)（A、陽性對(dui)照；B、不育系；C、保持系）
總(zong)結
對YY85，sYY85，ZY90和(he)sZY90的(de)(de)線(xian)粒(li)體(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組的(de)(de)綜合分(fen)析表明，廣泛的(de)(de)結構變(bian)異可能與不(bu)育(yu)有關，更具體(ti)地說(shuo)，四個候(hou)選CMS特(te)異性基(ji)(ji)因(yin)(yin)以及16個候(hou)選CMS特(te)定的(de)(de)ORF與CMS機(ji)制密切相關。它(ta)們(men)不(bu)僅代(dai)表了(le)與CMS相關的(de)(de)候(hou)選基(ji)(ji)因(yin)(yin)，而且還(huan)可以用作(zuo)(zuo)鑒定煙草中CMS系的(de)(de)分(fen)子(zi)標記(ji)。值(zhi)得注意的(de)(de)是，針對ATP6的(de)(de)PPI實(shi)驗進一步支持了(le)該(gai)候(hou)選CMS特(te)異性基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)重要性以及我們(men)研究結果的(de)(de)有效性。線(xian)粒(li)體(ti)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組信(xin)(xin)息的(de)(de)獨立(li)分(fen)析不(bu)足(zu)以揭示CMS機(ji)制。因(yin)(yin)此，迫(po)切需要來自多組學研究的(de)(de)更多有價值(zhi)的(de)(de)信(xin)(xin)息來進行后(hou)續工(gong)作(zuo)(zuo)。
TIPS
植物(wu)三(san)系(xi)簡稱三(san)系(xi)。植物(wu)三(san)系(xi)是指(zhi)的雄性不(bu)(bu)育系(xi)，雄性不(bu)(bu)育保持系(xi)，雄性不(bu)(bu)育恢復(fu)系(xi)這三(san)系(xi)。
不(bu)(bu)(bu)(bu)育(yu)(yu)系(xi)，不(bu)(bu)(bu)(bu)育(yu)(yu)系(xi)就是(shi)雄(xiong)性(xing)不(bu)(bu)(bu)(bu)育(yu)(yu)系(xi)的簡(jian)稱(cheng)。是(shi)指植物的雄(xiong)性(xing)器官退化或發育(yu)(yu)不(bu)(bu)(bu)(bu)正常,喪失了受精能(neng)力，自交不(bu)(bu)(bu)(bu)結(jie)實，但(dan)是(shi)雌蕊正常，可(ke)以接受其(qi)他植物品(pin)種的正常花粉(fen)可(ke)以結(jie)實的品(pin)系(xi)，所(suo)以稱(cheng)為(wei)雄(xiong)性(xing)不(bu)(bu)(bu)(bu)育(yu)(yu)系(xi)。
保(bao)持(chi)(chi)系，保(bao)持(chi)(chi)系就(jiu)是雄(xiong)性不(bu)(bu)育(yu)保(bao)持(chi)(chi)系的簡(jian)稱。不(bu)(bu)育(yu)系本身沒有花粉，保(bao)持(chi)(chi)系不(bu)(bu)能(neng)結實(shi)，為(wei)了年年有大量的純不(bu)(bu)育(yu)系種子(zi)，每一個不(bu)(bu)育(yu)系必須有一個專門給(gei)它(ta)授粉，使所得的下(xia)一代(dai)(dai)仍為(wei)不(bu)(bu)育(yu)系的品系。這(zhe)種使不(bu)(bu)育(yu)系能(neng)傳種接代(dai)(dai)的植物品系，稱為(wei)雄(xiong)性不(bu)(bu)育(yu)保(bao)持(chi)(chi)系。
恢(hui)(hui)復(fu)系(xi)(xi)，恢(hui)(hui)復(fu)系(xi)(xi)就是雄性不(bu)育恢(hui)(hui)復(fu)系(xi)(xi)的(de)簡稱(cheng)。保持(chi)系(xi)(xi)只能(neng)為不(bu)育系(xi)(xi)解(jie)決傳種(zhong)(zhong)(zhong)接代問(wen)題，不(bu)能(neng)解(jie)決生(sheng)產上應用的(de)大量雜(za)交(jiao)種(zhong)(zhong)(zhong)。必須用另一(yi)些(xie)特(te)定品(pin)種(zhong)(zhong)(zhong)給不(bu)育系(xi)(xi)授(shou)粉，使(shi)所得種(zhong)(zhong)(zhong)子種(zhong)(zhong)(zhong)出(chu)來的(de)植株雄蕊(rui)恢(hui)(hui)復(fu)正常(chang)，并能(neng)自交(jiao)結實，這些(xie)品(pin)種(zhong)(zhong)(zhong)或品(pin)系(xi)(xi)，稱(cheng)為雄性不(bu)育恢(hui)(hui)復(fu)系(xi)(xi)。
參考文獻：
Ruyi Wang , Xunhui Cai , Shengnan Hu ,et al.Comparative Analysis of the Mitochondrial Genomes of Nicotiana tabacum: Hints Toward the Key Factors Closely Related to the Cytoplasmic Male Sterility Mechanism[J]. Frontiers in Genetics. 2020, 11:257-272.
