2020-07-28
繼上篇的m6A（RNA甲基化）自我介紹之后（直戳 進入），今天我們一起來看看m6A修飾的檢測(ce)方法(fa)，用對(dui)方法(fa)，事半功(gong)倍。
根據m6A（RNA甲基化）檢測平臺，我們將其分為質(zhi)譜法、光(guang)譜比色法和(he)高通(tong)量測序(xu)法（meRIP-seq）。
該方(fang)法(fa)(fa)主要通(tong)過使(shi)用結合酶處理和(he)(he)離子打(da)(da)碎的方(fang)式(shi)，把核酸打(da)(da)碎成核苷和(he)(he)堿基，通(tong)過質譜(pu)譜(pu)圖和(he)(he)峰強(qiang)度(du)計算出(chu)m6A和(he)(he)總(zong)A的比例，從而(er)得知m6A的整體(ti)水平(ping)(ping)。此種(zhong)方(fang)法(fa)(fa)無法(fa)(fa)將m6A修飾(shi)定(ding)量到具(ju)體(ti)是哪種(zhong)RNA發生了修飾(shi)以(yi)及修飾(shi)的具(ju)體(ti)位置，并(bing)且操作(zuo)較為復雜，價(jia)格(ge)較為昂(ang)貴，平(ping)(ping)臺限(xian)制較強(qiang)。
圖1 質譜檢測m6A修(xiu)飾的核苷色(se)譜圖
該方法(fa)同(tong)質譜法(fa)相同(tong)的一點在(zai)于：都是揭示樣本m6A修(xiu)飾總體(ti)水平，但是方法(fa)更為簡單(dan)易(yi)操作。其方法(fa)原理類似于蛋白(bai)的Elisa檢測。將目標(biao)RNA同(tong)m6A抗(kang)體(ti)孵育(yu)，然(ran)后將孵育(yu)后液(ye)體(ti)轉移至包被m6A的孔(kong)板(ban)中(zhong)孵育(yu)，然(ran)后洗(xi)脫（只有和孔(kong)板(ban)中(zhong)m6A結合的m6A抗(kang)體(ti)才能保留下來），進(jin)行(xing)抗(kang)體(ti)信號(hao)(hao)生成(cheng)反應，最(zui)后檢測抗(kang)體(ti)信號(hao)(hao)。在(zai)整個實(shi)驗過程中(zhong)會使用到標(biao)準(zhun)(zhun)品的標(biao)準(zhun)(zhun)曲線進(jin)行(xing)精準(zhun)(zhun)定量。該方法(fa)一大優點是目前市面(mian)上已有眾多成(cheng)熟的試劑盒，可(ke)直(zhi)接(jie)購買使用，方法(fa)成(cheng)熟，操作簡單(dan)，靈敏度高。
圖2 比色法檢測樣本中的m6A整體水平
高(gao)通量(liang)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)，相信關注(zhu)過我們(men)(men)公眾號的(de)老師們(men)(men)都不陌生(sheng)，高(gao)通量(liang)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)主要是(shi)依(yi)賴于高(gao)通量(liang)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)儀對核苷酸序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列實現序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列組成測(ce)定(ding)的(de)技(ji)術(shu)，因此，通過高(gao)通量(liang)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)術(shu)檢測(ce)m6A修飾（其中應(ying)用熱門的(de)技(ji)術(shu)就是(shi)MeRIP-seq）。那么我們(men)(men)就可(ke)以得知發生(sheng)甲基(ji)化(hua)修飾的(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列來(lai)源于哪個基(ji)因，甚(shen)至得知它的(de)位置信息。具體(ti)怎么實現的(de)呢？我們(men)(men)一起看一下。
圖3 高通量測序技術檢測m6A的詳(xiang)細位置和修飾水平
1、針對全(quan)基(ji)因組(zu)范圍內檢測m6A的存在(zai)；
2、m6A的檢測結(jie)果可以精確到基因；
3、能夠(gou)明確每個基因的修飾水(shui)平，進行組與(yu)組之間比(bi)較；
4、檢測平臺為測序儀，儀器限制低，通用性高，重復性好(hao)；
5、結(jie)果可(ke)以(yi)和其他(ta)組學聯合分析(xi)，從多維(wei)度(du)講述(shu)機(ji)(ji)制機(ji)(ji)理(li)故事；
6、實驗操作簡(jian)單(dan)，入門容易。
希望通過今天的(de)介紹，對于想(xiang)做m6A修飾研究(jiu)的(de)老師能(neng)提供一些幫助(zhu)，明確自己的(de)研究(jiu)目的(de)，選擇合(he)適的(de)檢測方法，得到(dao)符合(he)預期的(de)結果，發出高分的(de)文章~~
