2020-08-04
2020年6月《nature communications》期刊發表了一篇題為“A megaplasmid family driving dissemination of multidrug resistance in Pseudomonas”的文章，揭示了假單胞菌中的大質粒家族中的多重耐藥性的特性及相關大質粒的進化關系。 一(yi)、研究(jiu)背景(jing) 抗(kang)生素的(de)耐(nai)藥(yao)(yao)性（AMR）傳播被(bei)認為是(shi)(shi)對人(ren)類健康的(de)一個(ge)關(guan)鍵(jian)的(de)全球挑戰，ESKAPE病原體（糞腸(chang)(chang)球菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、金黃色葡萄球菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、肺炎克雷伯菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、鮑曼不動(dong)桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、銅綠(lv)假(jia)(jia)單胞(bao)(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)和腸(chang)(chang)桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)屬）是(shi)(shi)全世界(jie)醫院內感染的(de)主(zhu)要(yao)原因。特別是(shi)(shi)銅綠(lv)假(jia)(jia)單胞(bao)(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)，該菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)通常與多重耐(nai)藥(yao)(yao)性（MDR）相關(guan)，已被(bei)世界(jie)衛生組織列為與抗(kang)生素耐(nai)藥(yao)(yao)性相關(guan)的(de)重要(yao)病原體。在泰國，銅綠(lv)假(jia)(jia)單胞(bao)(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)對碳青霉(mei)烯(xi)的(de)耐(nai)藥(yao)(yao)性是(shi)(shi)一個(ge)日益嚴(yan)重的(de)問題，之(zhi)前(qian)的(de)研(yan)究試圖闡明在臨床分(fen)離的(de)銅綠(lv)假(jia)(jia)單胞(bao)(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)中碳青霉(mei)烯(xi)耐(nai)藥(yao)(yao)的(de)遺傳基(ji)礎，但對質粒的(de)作用知之(zhi)甚少。本文(wen)采用二代+三(san)代的(de)測序方法對銅綠(lv)假(jia)(jia)單胞(bao)(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)進(jin)行測序，獲得假(jia)(jia)單胞(bao)(bao)(bao)(bao)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)中與多重耐(nai)藥(yao)(yao)相關(guan)的(de)質粒，通過比較基(ji)因組等分(fen)析研(yan)究其水平轉移(yi)能力以及進(jin)化(hua)關(guan)系等。 二、材料與方法 1、實驗材(cai)料 從泰國(guo)曼谷瑪希(xi)隆大學Ramathibodi醫院(yuan)獲(huo)得48株與(yu)不(bu)同感(gan)染(ran)相關(guan)的(de)分(fen)離菌(jun)(jun)株，對48株分(fen)離株進行藥敏實(shi)驗，根據結(jie)果將其分(fen)為(wei)敏感(gan)型(xing)、中間型(xing)以及抗性菌(jun)(jun)株。 2、測(ce)序方法及組(zu)裝 （1）二代：從(cong)48株(zhu)中選取(qu)23株(zhu)敏感型和抗性菌(jun)株(zhu)進行Illumina Miseq測(ce)序，測(ce)序數據采用A5-Miseq進行組裝； （2）三代：選取抗性最(zui)強的3株進(jin)行Pacbio RSII測(ce)序，測(ce)序數據采用HAGP v.3進(jin)行組裝。 3、基因組注釋(shi)、預測及比較基因組分析(xi) 對測序(xu)獲得的序(xu)列進行基因組(zu)拼接組(zu)裝以及(ji)基因預(yu)測，對獲得的序(xu)列進行比較基因組(zu)分析。 三、實驗結果與分析 1、臨床分(fen)離株(zhu)的抗菌(jun)藥敏(min)性(xing) 對(dui)收(shou)集到的(de)48株(zhu)與不同感(gan)染類型相(xiang)關(guan)的(de)銅綠假(jia)單(dan)胞菌分離株(zhu)進行(xing)藥敏實驗，其中有(you)9株(zhu)對(dui)5種(zhong)(zhong)抗生(sheng)素(su)全部具有(you)抗性，有(you)6株(zhu)對(dui)5種(zhong)(zhong)抗生(sheng)素(su)中的(de)4種(zhong)(zhong)具有(you)抗性。 2. pBT2436和pBT2101 抗生素耐藥(yao)性研究 選取抗性(xing)最強的3株分(fen)離(li)株2101、2436和(he)4068進(jin)行Pacbio測序，2101和(he)2436分(fen)別(bie)得到了一(yi)條完整染色體(ti)（6,782,092bp、6,573,638bp）和(he)一(yi)個(ge)(ge)(ge)環形質(zhi)粒（命名為(wei)pBT2101（423kb）和(he)pBT2436（440kb））。對這兩個(ge)(ge)(ge)質(zhi)粒進(jin)行比較發(fa)現，pBT2101有(you)一(yi)個(ge)(ge)(ge)重復(fu)區域（RR1）和(he)一(yi)個(ge)(ge)(ge)可(ke)(ke)變(bian)區（VR1），pBT2436有(you)兩個(ge)(ge)(ge)重復(fu)區（RR1和(he)RR2），但沒有(you)可(ke)(ke)變(bian)區。其中分(fen)離(li)株4068組成5條contig，有(you)一(yi)個(ge)(ge)(ge)51kb的質(zhi)粒但是不含(han)有(you)抗性(xing)基因，故(gu)本文未做進(jin)一(yi)步研究。 對pBT2101和(he)(he)pBT2436進行注釋(shi)，發現(xian)RR1區含(han)有(you)大量的AMR基(ji)因，包(bao)括一(yi)些共(gong)有(you)的和(he)(he)特(te)有(you)的mer操縱子、轉座酶、整合酶、重復序列，但(dan)在(zai)核苷酸水平上基(ji)因含(han)量、序列同一(yi)性(xing)及排列位置上存(cun)(cun)在(zai)差(cha)(cha)異(yi)；同時轉座子插入導(dao)致(zhi)一(yi)部分(fen)基(ji)因長度(du)發生變化(hua)從而導(dao)致(zhi)共(gong)有(you)區域存(cun)(cun)在(zai)一(yi)定的差(cha)(cha)異(yi)。對兩個質粒(li)進行IS序列預(yu)測，得到8種(zhong)IS序列類型(xing)，其中Tn5393，IS6100和(he)(he)TnAs3為兩者共(gong)有(you)的，預(yu)測得到的序列中包(bao)含(han)一(yi)部分(fen)抗性(xing)基(ji)因，這表明IS序列在(zai)獲得不同來(lai)源的抗性(xing)中起關鍵作用(yong)。 將pBT2436染色體進行比對發現，與菌株PAO1具有相同的染色體序列，菌株2436、PAO1與pBT2436的RR2區比對僅有78%的相似性，排除RR2區來源于菌株染色體；將RR2區序列在數據庫中進行blast，發現同源性最高的為A. hydrophila WCHAH045096，與非相關質粒pBKPC18-1(C.freundii) 和 pMKPA34-1(P. aeruginosa)相似性也比較高，主要區別是存在與各種IS相關的基因，暗示了這些基因在傳播中的作用。這些抗性區的動態性質與其余質粒主鏈的一般保守性相反，表明抗性基因已在不同質粒背景中獨立組裝。 3. 臨床(chuang)分離株中相關大質粒的分布 為了確定相關質粒是否存在于同一家醫院的其他P. aeruginosa中，選擇了23種耐藥性較高和耐藥性較低的臨床分離株（包括2101和2436）進行二代測序。從基因組中提取的多基因組序列類型（MLST）和基于kmer序列比較表明，分離株在遺傳上高度多樣化。 以pBT2101和(he)(he)pBT2436為參考基因組對(dui)測序(xu)分離(li)(li)株(zhu)進行(xing)mapping，分離(li)(li)株(zhu)3583和(he)(he)638分別與pBT2101和(he)(he)pBT2436保持(chi)高度相(xiang)(xiang)似性，表明這兩(liang)個(ge)(ge)(ge)分離(li)(li)株(zhu)中(zhong)存在(zai)相(xiang)(xiang)關質(zhi)粒。其中(zhong)分離(li)(li)株(zhu)2436和(he)(he)638來源于(yu)(yu)同(tong)一患者但是不同(tong)來源的(de)(de)樣(yang)品中(zhong)分離(li)(li)得到的(de)(de)，它們具有相(xiang)(xiang)同(tong)的(de)(de)序(xu)列（ST)；來源于(yu)(yu)不同(tong)患者的(de)(de)分離(li)(li)株(zhu)2101和(he)(he)3583在(zai)7個(ge)(ge)(ge)MLST基因座中(zhong)的(de)(de)6個(ge)(ge)(ge)具有相(xiang)(xiang)同(tong)的(de)(de)序(xu)列，它們的(de)(de)質(zhi)粒具有很高的(de)(de)一致性，但分離(li)(li)株(zhu)3583中(zhong)的(de)(de)質(zhi)粒僅攜帶一個(ge)(ge)(ge)抗性基因拷(kao)貝而不是兩(liang)個(ge)(ge)(ge)。 4. pBT2436-like大質粒家族 為了更好的研究與多藥耐藥性質粒相關的大質粒家族，以pBT2436和pBT2101序列在NCBI數據庫中進行blast，結果得到13種其他大質粒，大小在370至501 kb之間，編碼基因在456至623之間。其中10個大質粒屬于P. aeruginosa，另外三個屬于P. putida（人的尿路感染有關）， P. citronellolis 和 P. koreensis。 對(dui)15個(ge)完整大(da)質粒序(xu)列的(de)比較(jiao)分(fen)析(xi)顯(xian)示，它們具(ju)有較(jiao)高(gao)的(de)同(tong)義度和廣泛的(de)序(xu)列相(xiang)似(si)性，檢測到的(de)變(bian)異分(fen)布在整個(ge)基因組的(de)離(li)散位點上（主要集中在富含AMR基因、轉(zhuan)座(zuo)酶(mei)和整合酶(mei)基因的(de)大(da)區域），但大(da)質粒組的(de)任何其(qi)他成(cheng)員都不存在pBT2101 的(de)7.7kb可變(bian)區（對(dui)VR1進行注釋(shi)發現(xian)該(gai)去(qu)并無AMR基因）。 5、pBT2436-like大質(zhi)粒的核心和輔助基因組分析(xi) 基于15個質粒基因組進行比較得到261個直系同源蛋白質組組成的核心基因組，平均每個質粒約有48%的核心基因組（范圍為42–57％），泛基因組分析得到1164個共有基因家族。核心基因組和泛基因組的稀釋和積累曲線表明，隨著基因組數量的增加其核心基因組的數量不會受到太大影響。 6、 pBT2436-like大(da)質粒家族(zu)的系統發育分(fen)析 基(ji)于（a）核心基(ji)因的核苷酸組成（n = 105）和（b）泛基(ji)因組（存在(zai)或不(bu)存在(zai)蛋(dan)白質簇）構(gou)建系統發育樹，發現： （1）在(zai)中國(guo)分離得到5個巨質(zhi)粒(包(bao)括P.putida)； （2）兩個大質(zhi)粒pOZ176（來自中國）和pJB37（來自葡萄牙）； （3）兩個了解很少的大(da)質粒（菌株AR_0356和AR441）分別聚集(ji)成簇。 pBT2436和(he)pBT2101通過(guo)基(ji)因(yin)(yin)組分析比通過(guo)核心基(ji)因(yin)(yin)組分析更緊密地聚集在一起，這表明由于加入了(le)輔助基(ji)因(yin)(yin)（與AMR相關(guan)）而導致了(le)一些融(rong)合。 根據AMR基因含量繪制熱圖，發現： （1）在非銅綠假單胞菌(p1和(he)pRBL16)中發現的兩(liang)個巨質粒來自于非人類來源，不具有AMR基因； （2）質粒pST153從中國一例泌尿系感染菌株P. putida 中分離得到的，與其他來源于中國的質粒在AMR基因上具有一定的相似性。 7、pBT2436-like巨質粒家族的廣泛分布 為了確定大質粒家族的(de)(de)廣泛分(fen)布(bu)，將pBT2436序列放到(dao)(dao)NCBI上檢索假單胞菌基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)中(zhong)相關的(de)(de)大質粒，從(cong)比對上的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)中(zhong)獲取其(qi)原始數據。以pBT2436序列為參考基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)進(jin)行mapping，發現mapping率最高(gao)為96.6%，是1986年從(cong)日本(ben)分(fen)離得(de)到(dao)(dao)的(de)(de)P.montelii中(zhong)的(de)(de)質粒；比對上最早的(de)(de)是1970年從(cong)日本(ben)發現的(de)(de)P. aeruginosa，mapping率為86.3%。從(cong)核心基(ji)(ji)因(yin)(yin)中(zhong)選擇4個(ge)(ge)核心基(ji)(ji)因(yin)(yin)進(jin)行系(xi)統(tong)發育(yu)樹(shu)構建，揭(jie)示(shi)了新的(de)(de)多樣(yang)性模式。值(zhi)得(de)注意的(de)(de)是，只要4個(ge)(ge)系(xi)統(tong)發育(yu)標記基(ji)(ji)因(yin)(yin)來推斷樹(shu)，表明(ming)這些(xie)基(ji)(ji)因(yin)(yin)可以形成一個(ge)(ge)分(fen)型系(xi)統(tong)的(de)(de)基(ji)(ji)礎。 8、大質粒的穩定性(xing)和適應(ying)性(xing)成本(ben) 通過使宿主細菌在非選擇性培養基中循環生長三輪（約60代）并篩選維持妥布霉素抗性的方法來檢測pBT2436的穩定性，結果并沒有抗性喪失。為了解大質粒獲取的適應性進行競爭性適應性檢測，在檢測中帶有大質粒的P.fluorescens直接與等基因的、標記不同的無質粒競爭者競爭。令人驚訝的是，盡管pOZ176和p1的規模很大，但它們都沒有對競爭增長造成顯著的成本；但檢測到兩種質粒均大量轉移至競爭者中，并且未檢測到pOZ176或p1的丟失。這些實驗數據表明，由于適應性成本低，傳播速率高和基因含量高，pBT2436-like大質粒可能是環境中假單胞菌之間傳播抗藥性的有力載體，這與基因組分析結果一致。 四(si)、結(jie)論 1.獲得(de)了兩個緊(jin)密相關的(de)大質粒（> 420 kb）的(de)完整序列，攜帶著(zhu)位于(yu)離散、復雜和動態耐藥區域的(de)大量抗生素(su)耐藥基(ji)因，并(bing)揭示(shi)了廣泛的(de)復制和重(zhong)組事件。 2.全(quan)面的(de)基(ji)因組學(xue)和系統基(ji)因組學(xue)分析表明(ming)： 1）大質粒(li)中包含假單胞菌不同(tong)成(cheng)員中新出現的(de)家族屬，并(bing)與多種(zhong)來源（地理，臨床(chuang)或環境）相(xiang)關； 2）大質粒編碼各種適應生態位的輔助性(xing)狀，包(bao)括多藥耐藥性(xing)； 3）大質(zhi)粒家(jia)族的輔助基因組(zu)具有高度的靈活性和多樣性 3.對可用數據庫(ku)的分析(xi)中(zhong)可以(yi)推(tui)斷出(chu)大質(zhi)粒(li)家族的歷史，表明攜帶多個抗(kang)性基因的成員(yuan)至少可以(yi)追溯(su)到1970年代。 點擊閱(yue)讀全文：
