2020-08-12
RNA甲基化作(zuo)為當下“國自然”研(yan)究熱(re)點，熱(re)度只增不減(jian)。小(xiao)派君還(huan)(huan)會持續給大家帶來更多知識與(yu)研(yan)究思路，還(huan)(huan)沒有關(guan)注我(wo)們(men)的小(xiao)可(ke)愛們(men)來波關(guan)注吧~
今天我們要(yao)給大家分享的(de)是RNA甲基化(hua)的(de)研(yan)究(jiu)思路，帶大家更好的(de)理解RNA甲基化(hua)測(ce)序（MeRIP-seq）技術的(de)應用。
在介紹研究思路之前(qian)，我們要知(zhi)道m6A甲基化過(guo)程中涉(she)及的這3類(lei)重(zhong)要的酶(mei)：
1、Writers，甲基化(hua)酶，催化(hua)m6A甲基化(hua)的(de)發(fa)生；
2、Erasers，去(qu)甲基化(hua)酶(mei)：去(qu)除m6A甲基化(hua)的(de)修(xiu)飾；
3、Readers，m6A識別蛋白(bai)，識別m6A修(xiu)飾位點。m6A修(xiu)飾被(bei)不同的(de)reader識別會發揮不同的(de)生物學功能，如影響(xiang)mRNA的(de)剪接、出核(he)、定位、翻譯和穩定性等。
一、構建m6A轉(zhuan)錄組修飾譜
構建(jian)m6A轉錄組(zu)(zu)修(xiu)飾譜(pu)，通過MeRIP-Seq看(kan)整個轉錄組(zu)(zu)的(de)m6A修(xiu)飾情(qing)況，得到(dao)發生m6A修(xiu)飾的(de)基因以及m6A的(de)修(xiu)飾水平。也更適合多(duo)數非模(mo)式物種來(lai)做，以及在沒有條件開展(zhan)較多(duo)生化實(shi)驗以及分子互作機制的(de)時候選(xuan)擇。如(ru)果覺得單一(yi)組(zu)(zu)學(xue)太(tai)單薄，可以做多(duo)組(zu)(zu)學(xue)整合研究，基于(yu)多(duo)組(zu)(zu)學(xue)數據(ju)尋找表(biao)面調控規律(lv)。
當(dang)然，若不想(xiang)看整(zheng)(zheng)個轉錄組的m6A修(xiu)飾情(qing)況，可以(yi)做MeRIP-qPCR，針對目(mu)標(biao)基因(yin)(yin)看m6A修(xiu)飾水平(ping)；若只(zhi)想(xiang)看整(zheng)(zheng)體(ti)m6A水平(ping)變化(hua)，不看基因(yin)(yin)層面(mian)的，可以(yi)用Dot blot、LC-MSMS、Elisa等方(fang)法看整(zheng)(zheng)體(ti)修(xiu)飾水平(ping)的變化(hua)。
參考文(wen)獻：
Jabs S, Biton A, Bécavin C, et al. Impact of the gut microbiota on the m6A epitranscriptome of mouse cecum and liver. Nat Commun. 2020;11(1):1344. Published 2020 Mar 12.
二、m6A甲基(ji)化與轉(zhuan)錄組聯合分析
MeRIP-Seq與RNA-Seq聯合分析，可以同時得到基因的m6A修飾水平與表達水平，在結果中可挖掘Writers的靶基因，并結合RIP實驗驗證。這兩個組學整合后的結果分5種情況：都上調、都下調、m6A水平上調但表達水平下調、m6A水平下調但表達水平上調、以及均無變化。由于不同reader會引起RNA的命運朝著不同方向改變，因此聯合分析的結果可以通過生化與實驗去驗證，挖掘分子機制。
參考文獻：
Song T, Yang Y, Wei H, et al. Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and post-transcriptional regulation to promote adipogenic differentiation. Nucleic Acids Res. 2019;47(12):6130-6144.
三、關(guan)鍵酶與下游基因(yin)靶(ba)向關(guan)系(xi)驗證(zheng)
通過RNA-pull-down與RIP等實驗，探索與目的基因特異性結合的蛋白。這可以用作RNA甲基化關鍵酶與基因之間互作關系的挖掘與驗證。由于目前已明確鑒定到了很多writers、erasers與reader蛋白，并且也明確了很多reader的功能，這樣的話，如果發生m6A修飾的目標基因能被一個影響RNA穩定性的蛋白結合，那么就可以做RNA穩定性實驗來進一步驗證我們的發現；如果發現m6A修飾的基因被影響翻譯效率的RNA結合，那么可以做WB等蛋白定量實驗來驗證。
參考文(wen)獻(xian)：
Li T, Hu P S, Zuo Z, et al. METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma[J]. Molecular Cancer, 2019, 18(1).
四、敲(qiao)除/過(guo)表達RNA甲基(ji)化關鍵酶(mei)研(yan)究(jiu)下游機制
該(gai)思(si)路(lu)可用于RNA甲基(ji)化(hua)(hua)研(yan)究的(de)第一(yi)步(bu)，通過(guo)敲(qiao)除甲基(ji)化(hua)(hua)酶(mei)或者過(guo)表(biao)達去甲基(ji)化(hua)(hua)酶(mei)，觀察表(biao)型，以確(que)認某關(guan)鍵(jian)表(biao)型是(shi)否受RNA甲基(ji)化(hua)(hua)調控(kong)，若是(shi)，則開(kai)展(zhan)RNA甲基(ji)化(hua)(hua)測(ce)序、轉錄組測(ce)序等，來(lai)研(yan)究其中m6A修飾的(de)調控(kong)機制。該(gai)思(si)路(lu)也可以在做完RNA甲基(ji)化(hua)(hua)之后作為(wei)進一(yi)步(bu)的(de)驗證手段(duan)，在獲得基(ji)因(yin)m6A修飾情況后，通過(guo)敲(qiao)除或過(guo)表(biao)達readers，看reader的(de)靶基(ji)因(yin)的(de)命運，再進一(yi)步(bu)觀察相應表(biao)型。
參考文(wen)獻：
Lin X, Chai G, Wu Y, et al. RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail.[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).
五、m6A甲基化與(yu)翻譯(yi)組聯合分析
通過組學手段或者目(mu)標基(ji)因(yin)/蛋白(bai)(bai)的(de)定量手段獲得基(ji)因(yin)的(de)表(biao)(biao)達水(shui)(shui)平(ping)與(yu)蛋白(bai)(bai)表(biao)(biao)達水(shui)(shui)平(ping)，再通過m6A修飾水(shui)(shui)平(ping)與(yu)翻(fan)譯組檢測技術，以及RIP實驗等，尋找基(ji)因(yin)的(de)轉錄水(shui)(shui)平(ping)與(yu)蛋白(bai)(bai)表(biao)(biao)達水(shui)(shui)平(ping)的(de)背后機制。有部(bu)分reader在識(shi)別m6A修飾位點之后，會(hui)引起目(mu)標RNA的(de)穩定性(xing)、降(jiang)解(jie)、翻(fan)譯效率等問題。
參考文(wen)獻：
Vu L P, Pickering B F, Cheng Y, et al. The N6-methyladenosine (m6A)-forming enzyme METTL3 controls myeloid differentiation of normal hematopoietic and leukemia cells.[J]. Nature Medicine, 2017, 23(11): 1369-1376.
六(liu)、LncRNA甲基化(hua)介導的表(biao)型變(bian)化(hua)的分子機制(zhi)研究
雖然大(da)部分m6A修飾(shi)更(geng)多的集中(zhong)在mRNA中(zhong)，不(bu)過也有研究表明lncRNA上(shang)的m6A修飾(shi)也會影響lncRNA的命運，如對miRNA、蛋白的結(jie)合能力等，進而調控不(bu)同通路(lu)來影響生物(wu)學表型。
參考文(wen)獻(xian)：
Zhang S, Zhao BS, Zhou A, et al. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell. 2017;31(4):591-606.e6.
