2020-08-13
遺(yi)(yi)(yi)(yi)傳圖(tu)譜(pu)又稱連(lian)鎖圖(tu)譜(pu)、遺(yi)(yi)(yi)(yi)傳連(lian)鎖圖(tu)譜(pu)。如果說物理圖(tu)譜(pu)指(zhi)的(de)是堿基(ji)在DNA上的(de)線性排列，那么遺(yi)(yi)(yi)(yi)傳圖(tu)譜(pu)則指(zhi)基(ji)因(yin)或DNA分子(zi)標(biao)記在染色(se)體上的(de)排列順(shun)序了，根(gen)據選定(ding)的(de)基(ji)因(yin)或分子(zi)標(biao)記，以及這些標(biao)記之間的(de)重(zhong)組率(lv)為(wei)“圖(tu)距”確(que)定(ding)不同多態性標(biao)記位(wei)點在每條連(lian)鎖群上排列的(de)順(shun)序和遺(yi)(yi)(yi)(yi)傳距離所得到(dao)的(de)圖(tu)譜(pu)就稱為(wei)遺(yi)(yi)(yi)(yi)傳圖(tu)譜(pu)。
遺(yi)傳(chuan)圖譜(pu)的單(dan)位(wei)為(wei)厘摩(cM)，即基(ji)因(yin)或DNA片段在染色(se)體交(jiao)換過程中的重組頻率。距離(li)越(yue)遠，發生重組的概率越(yue)高。
遺(yi)(yi)傳圖(tu)譜主(zhu)要有四個方(fang)向的應(ying)用(yong)：數量(liang)性狀位(wei)點（Quantitative trait loci , QTLs）定位(wei)、輔助基因組(zu)組(zu)裝、比較基因組(zu)分(fen)(fen)析、分(fen)(fen)子標記(ji)輔助育(yu)種等[1]。遺(yi)(yi)傳圖(tu)譜構(gou)通過(guo)遺(yi)(yi)傳重(zhong)組(zu)分(fen)(fen)析將各類標記(ji)根據(ju)重(zhong)組(zu)率(lv)定位(wei)在染色體上。
因此，開發(fa)分(fen)子(zi)標記(ji)在遺傳(chuan)圖譜的(de)(de)(de)構建中是非常(chang)重要的(de)(de)(de)環節。傳(chuan)統的(de)(de)(de)遺傳(chuan)標記(ji)通(tong)過表型間(jian)接的(de)(de)(de)反映基因的(de)(de)(de)差(cha)異，而分(fen)子(zi)標記(ji)以DNA分(fen)子(zi)的(de)(de)(de)多態性為基礎，能(neng)夠更(geng)加直(zhi)接的(de)(de)(de)反映DNA水平的(de)(de)(de)遺傳(chuan)變異[1]。
隨著(zhu)分子標(biao)(biao)記(ji)(ji)的不(bu)(bu)斷(duan)發展，目(mu)前(qian)已經有(you)幾十種不(bu)(bu)同的分子標(biao)(biao)記(ji)(ji)技術(shu)，這些標(biao)(biao)記(ji)(ji)技術(shu)各有(you)優缺點，隨著(zhu)標(biao)(biao)記(ji)(ji)技術(shu)的不(bu)(bu)斷(duan)發展，目(mu)前(qian)常用的標(biao)(biao)記(ji)(ji)主要有(you)：RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)即(ji)限制性(xing)(xing)片段(duan)長度多(duo)態(tai)(tai)(tai)性(xing)(xing)、RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA)即(ji)隨機擴(kuo)增(zeng)多(duo)態(tai)(tai)(tai)性(xing)(xing) DNA、 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)即(ji)擴(kuo)增(zeng)片段(duan)長度多(duo)態(tai)(tai)(tai)性(xing)(xing) 、 SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)即(ji)序(xu)列(lie)(lie)特異(yi)擴(kuo)增(zeng)區(qu)域、CAPs(Cleaved Amplified Polymorohic Sequence)即(ji)切(qie)斷(duan)擴(kuo)增(zeng)多(duo)態(tai)(tai)(tai)性(xing)(xing)序(xu)列(lie)(lie)、SSR(Simple Sequence Repeat)即(ji)簡單(dan)重復序(xu)列(lie)(lie)或微衛星 DNA 標(biao)(biao)記(ji)(ji)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism)即(ji)單(dan)個核苷酸多(duo)態(tai)(tai)(tai)性(xing)(xing)標(biao)(biao)記(ji)(ji)等[1,2]。
重復(fu)堿基類的分子標(biao)記 當前，測(ce)序技(ji)術(shu)不斷發展，將高通量(liang)測(ce)序技(ji)術(shu)應用于(yu)分(fen)子標(biao)記(ji)的開發，能(neng)夠(gou)更加(jia)快速的得到(dao)更加(jia)豐富(fu)的分(fen)子標(biao)記(ji)。將高通量(liang)測(ce)序技(ji)術(shu)用于(yu)分(fen)子標(biao)記(ji)開發能(neng)夠(gou)節約大量(liang)的時間和成(cheng)本(ben)，常用于(yu)開發SSR、SNP等(deng)標(biao)記(ji)方法(fa)。 真核生(sheng)物基(ji)(ji)因(yin)組包含大(da)量由(you)1 - 6 bp的重(zhong)(zhong)復 DNA 片(pian)(pian)段構(gou)成的特定序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)，長度在1000bp以內(nei)，這段序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)就被稱為SSR序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)[4]。SSR序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)的突變率(lv)高，且對于不(bu)同的等位基(ji)(ji)因(yin)，其重(zhong)(zhong)復單(dan)元的重(zhong)(zhong)復次數差異很大(da)；但其兩端一般為高度保守的單(dan)拷貝(bei)序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)。在DNA修(xiu)復或復制(zhi)時(shi)，DNA序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)發(fa)(fa)生(sheng)錯(cuo)(cuo)配錯(cuo)(cuo)位導(dao)致(zhi)重(zhong)(zhong)復序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)數目發(fa)(fa)生(sheng)變化；在減數分裂、有絲分裂中姐妹染色單(dan)體交(jiao)換的不(bu)對等性(xing)也(ye)會產生(sheng)SSR序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)[5]。我(wo)們可以根據其兩端保守序(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)(lie)設(she)計(ji)引物擴(kuo)增，其重(zhong)(zhong)復區域拷貝(bei)數不(bu)同導(dao)致(zhi)最終片(pian)(pian)段長度也(ye)不(bu)同，根據分離片(pian)(pian)段的大(da)小判斷基(ji)(ji)因(yin)型(xing)，并計(ji)算(suan)等位基(ji)(ji)因(yin)發(fa)(fa)生(sheng)頻率(lv)[6]。 SSR是PCR技術類的(de)分子標(biao)記代表，其被廣泛應用與各類物種(zhong)的(de)遺傳(chuan)作圖(tu)研究中[5,7,8,9]。此外，還有(you)報道SSR在種(zhong)間(jian)也有(you)良好的(de)通(tong)用性[10]。 根據SSR的特點，其優點是顯(xian)而易見的： 共(gong)顯(xian)性標記檢(jian)，測單一的多等位(wei)(wei)基因位(wei)(wei)點； 鑒別雜合子和純(chun)合子； 檢測結果(guo)重(zhong)復(fu)性好，穩定可(ke)靠； 所需 DNA 量少。 早期測(ce)序手段(duan)欠缺，所以SSR標記(ji)的(de)前期開發成本(ben)較高，原(yuan)因是我們必須得到擴增SSR序列兩端的(de)保守序列；而很多(duo)時候，序列本(ben)身或其(qi)旁側(ce)序列并不清楚(chu)，這極大地限制了(le)該技術的(de)應用[11,12]。 傳統(tong)的開發(fa)(fa)的方法(fa)有很多，主要可分為以下三類：利用數據庫/相關文(wen)(wen)獻、利用近緣(yuan)物的序(xu)(xu)列擴增或從(cong)gDNA、cDNA、EST中篩選。現在，測(ce)序(xu)(xu)技術(shu)不斷發(fa)(fa)展，我們(men)利用高通(tong)量(liang)技術(shu)，通(tong)過(guo)構建一(yi)個SSR文(wen)(wen)庫（圖一(yi)），一(yi)次(ci)測(ce)序(xu)(xu)就能得到(dao)大量(liang)的SSR序(xu)(xu)列并(bing)統(tong)計這(zhe)些序(xu)(xu)列的多態(tai)性（圖二）。通(tong)過(guo)高通(tong)量(liang)測(ce)序(xu)(xu)能夠(gou)極大地節(jie)約開發(fa)(fa)成本和時間，且有無參(can)考基因組均可，適用性較廣。 圖一 SSR分(fen)子標記開發流程 圖二 派森諾SSR分子標記(ji)開發結果展示(shi) 單(dan)堿基的分子標記(ji) 單個(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)多態性標(biao)記(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指DNA上單個(ge)(ge)核(he)苷酸(suan)的變(bian)異（如突變(bian)、插入和缺失等）導致的DNA序列(lie)多態性[13,14]。 SNP位點普遍存在于生物的(de)基(ji)因組中，目(mu)(mu)前(qian)(qian)已經發(fa)展成(cheng)為最廣泛的(de)標記[15，16]。在不同樣本之(zhi)前(qian)(qian)開發(fa)SNP標記，目(mu)(mu)前(qian)(qian)常(chang)用的(de)測(ce)序策略(lve)就是(shi)簡化(hua)基(ji)因組測(ce)序和全基(ji)因組測(ce)序兩種方案。 以(yi)往，出于成本考(kao)慮(lv)，研究者通(tong)常(chang)采取對全(quan)(quan)基(ji)(ji)因組(zu)的(de)(de)(de)(de)一(yi)部分(fen)進行測(ce)序的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)案(an)(即(ji)簡(jian)(jian)化基(ji)(ji)因組(zu)測(ce)序，Simplified genome sequencing) ，其(qi)核(he)心(xin)策略就是(shi)(shi)(shi)利用(yong)限(xian)制(zhi)性(xing)內切酶(mei)來(lai)得到全(quan)(quan)基(ji)(ji)因組(zu)的(de)(de)(de)(de)一(yi)部分(fen)，對該(gai)部分(fen)測(ce)序以(yi)達(da)到測(ce)相(xiang)同數據量獲得更(geng)高測(ce)序深度(du)的(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)。目前簡(jian)(jian)化基(ji)(ji)因組(zu)的(de)(de)(de)(de)測(ce)序方(fang)(fang)案(an)多(duo)種(zhong)多(duo)樣(yang)，常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法主(zhu)要(yao)為(wei)RAD（Restriction site Associated DNA）和GBS（Genotyping-By-Sequencing），其(qi)余如2b-RAD，dd-RAD，SLAF等方(fang)(fang)案(an)都是(shi)(shi)(shi)以(yi)RAD和GBS為(wei)基(ji)(ji)礎的(de)(de)(de)(de)改良方(fang)(fang)案(an)，各簡(jian)(jian)化方(fang)(fang)案(an)詳細比較如表(biao)一(yi)所(suo)示。RAD和GBS的(de)(de)(de)(de)主(zhu)要(yao)區別在(zai)于GBS僅使用(yong)限(xian)制(zhi)性(xing)內切酶(mei)對DNA片段(duan)化并測(ce)序，而(er)RAD先用(yong)限(xian)制(zhi)性(xing)內切酶(mei)酶(mei)切DNA，隨(sui)后經行超聲波(bo)隨(sui)機(ji)打斷。目前常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)簡(jian)(jian)化基(ji)(ji)因組(zu)建(jian)庫方(fang)(fang)案(an)中最(zui)常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)就是(shi)(shi)(shi)RAD和dd-RAD方(fang)(fang)案(an)了，圖二是(shi)(shi)(shi)兩種(zhong)方(fang)(fang)案(an)的(de)(de)(de)(de)流(liu)程(cheng)，可(ke)以(yi)明顯發現RAD方(fang)(fang)案(an)比dd-RAD方(fang)(fang)案(an)更(geng)加(jia)繁瑣，成本更(geng)高，但是(shi)(shi)(shi)RAD方(fang)(fang)案(an)更(geng)加(jia)適(shi)合無參(can)考(kao)基(ji)(ji)因組(zu)的(de)(de)(de)(de)物種(zhong)，所(suo)以(yi)當我們確定實驗方(fang)(fang)案(an)時還(huan)是(shi)(shi)(shi)要(yao)根(gen)據需要(yao)來(lai)選擇合適(shi)的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)案(an)。 以(yi)往很多遺傳(chuan)圖(tu)譜(pu)(pu)基(ji)于簡化(hua)(hua)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)，遺傳(chuan)圖(tu)譜(pu)(pu)的(de)飽和度相對不足；另一方面(mian)，簡化(hua)(hua)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)由(you)于其自身特點導致測(ce)(ce)序(xu)(xu)結果(guo)在全(quan)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)中覆蓋度較低，對后續(xu)實驗有一定的(de)影響。相比于簡化(hua)(hua)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)，全(quan)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)可以(yi)更(geng)快更(geng)準確的(de)開發(fa)大量適于遺傳(chuan)圖(tu)譜(pu)(pu)構(gou)建的(de)分(fen)子標(biao)記并(bing)構(gou)建出高密(mi)度的(de)遺傳(chuan)圖(tu)譜(pu)(pu)。隨(sui)著測(ce)(ce)序(xu)(xu)成本的(de)大幅下(xia)降、對遺傳(chuan)圖(tu)譜(pu)(pu)的(de)密(mi)度要(yao)求越(yue)來越(yue)高，在遺傳(chuan)圖(tu)譜(pu)(pu)構(gou)建方面(mian)，全(quan)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)已(yi)經比簡化(hua)(hua)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)更(geng)具優(you)勢了。 表一 各簡化方案比較 圖(tu)二(er) RAD和dd-RAD方(fang)案(an)實驗流(liu)程 1.克(ke)拉(la)克(ke)，顧紅雅，瞿禮嘉．植(zhi)物(wu)分子生物(wu)學——實驗手(shou)冊[M].北京(jing)：高等(deng)教育(yu)出(chu)版社，1998. 2.周延清，楊清香，張改(gai)娜.生物遺傳標記與應用(yong)[M].化學工業(ye)出版社，2008.6 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