2020-08-14
上(shang)次通過簡單的入門知(zhi)識，，我們對(dui)空(kong)間轉錄組(zu)(zu)的(de)基礎信息做了(le)一(yi)個(ge)了(le)解，那么(me)，經過(guo)手術或者是(shi)基礎實驗(yan)，獲(huo)得了(le)一(yi)系(xi)列腫瘤及其(qi)臨近組(zu)(zu)織(zhi)的(de)組(zu)(zu)織(zhi)樣(yang)本和病理(li)切片，想要(yao)發表高分文章，針(zhen)對(dui)手上的(de)資源(yuan)，可提出怎(zen)樣(yang)的(de)生(sheng)物學問題？又要(yao)如(ru)何設計(ji)實驗(yan)解決提出的(de)問題呢？
下面咱們就以(yi)這篇今年發(fa)表于nature biotechnology的(de)關于胰腺癌的(de)文(wen)章為例，來聊聊這個(ge)文(wen)章思路的(de)關鍵(jian)問題(ti)。
文章中對思路進(jin)行(xing)了概述：
整理下來即為：
首先，作(zuo)者(zhe)對兩例(li)胰腺癌(ai)患者(zhe)的(de)(de)(de)樣本進(jin)行了單細(xi)(xi)胞(bao)測序，發現了一個非常有意(yi)思的(de)(de)(de)結果(guo)：PDAC-A病例(li)中有兩類(lei)不同(tong)類(lei)別(bie)的(de)(de)(de)腫瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)；而PDAC-B病例(li)中只有一種類(lei)別(bie)的(de)(de)(de)腫瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)（圖1）。于是，一個生物學問題產生了：這(zhe)兩個病例(li)中的(de)(de)(de)總共三類(lei)腫瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)，彼此之間(jian)有怎(zen)樣的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)(yi)？在(zai)基因表達水平，信號傳(chuan)導(dao)水平，空間(jian)分布水平，以及與其它類(lei)別(bie)細(xi)(xi)胞(bao)間(jian)通訊水平，是否存在(zai)差(cha)異(yi)(yi)，這(zhe)些差(cha)異(yi)(yi)，以怎(zen)樣的(de)(de)(de)形式進(jin)行闡(chan)釋(shi)？
圖1：單細胞測序結(jie)果展示
針對上面(mian)的(de)問題，主要(yao)(yao)目的(de)其實就是一方面(mian)想要(yao)(yao)得到客(ke)觀全面(mian)的(de)信息，而一方面(mian)想要(yao)(yao)聚焦于(yu)病理切片去闡(chan)述一些信息，對于(yu)切片方面(mian)的(de)進一步研究，空間轉錄組(zu)測(ce)序(xu)研究無疑是較優選擇。
其次，作(zuo)者(zhe)對上述兩例(li)病例(li)也收集了病理切片樣本，針對病理切片進(jin)行空間轉錄(lu)組測(ce)序分(fen)析，最后(hou)通過MIA (Multimodal intersection analysis) 分(fen)析將單(dan)細胞分(fen)析結(jie)(jie)(jie)果(guo)(guo)(guo)和空間轉錄(lu)組結(jie)(jie)(jie)果(guo)(guo)(guo)進(jin)行聯(lian)合分(fen)析，獲得了一(yi)些關鍵(jian)性結(jie)(jie)(jie)果(guo)(guo)(guo)：
01、關注空(kong)間轉(zhuan)錄組數據的(de)(de)特定亞(ya)群(qun)內(nei)，分析在(zai)(zai)這(zhe)一區域(yu)的(de)(de)各單(dan)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄組數據亞(ya)群(qun)，旨在(zai)(zai)揭示(shi)腫瘤區域(yu)內(nei)的(de)(de)含(han)(han)有哪(na)些細(xi)胞(bao)類(lei)型(xing)。結果顯示(shi)，在(zai)(zai)PDAC-A中(zhong)(zhong)，腫瘤區域(yu)除了富(fu)(fu)含(han)(han)腫瘤細(xi)胞(bao)，也富(fu)(fu)含(han)(han)成(cheng)纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)，而(er)在(zai)(zai)PDAC-B中(zhong)(zhong)，則并不(bu)富(fu)(fu)含(han)(han)成(cheng)纖維(wei)(wei)細(xi)胞(bao)（圖2，3）。
圖2：空(kong)間(jian)轉錄(lu)組（ST）結(jie)果展示(shi)（a，b:帶注(zhu)釋的(de)(de)PDAC-A和PDAC-B腫(zhong)瘤(liu)冷凍切片。c，d：PDAC-A和PDAC-B ST數據集中的(de)(de)三個基因(yin)的(de)(de)標準化(hua)表達水平。e，f：PDAC-A和PDAC-B ST點陣的(de)(de)聚(ju)類(lei)）
圖3：不同樣本空間轉(zhuan)錄組的(de)空間亞群(qun)(qun)內不同細胞類群(qun)(qun)的(de)比(bi)較
02、關注單細(xi)(xi)胞(bao)數據(ju)(ju)的(de)(de)特(te)定亞(ya)(ya)群，分(fen)析這(zhe)些亞(ya)(ya)群分(fen)布在(zai)哪些空間轉錄組數據(ju)(ju)的(de)(de)亞(ya)(ya)群中(zhong)，旨在(zai)揭示(shi)(shi)同一類(lei)別(bie)的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)，分(fen)別(bie)聚集分(fen)布在(zai)腫瘤(liu)的(de)(de)哪個區域。根據(ju)(ju)單細(xi)(xi)胞(bao)轉錄組的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)亞(ya)(ya)群分(fen)類(lei)結(jie)果(guo)，聯合空間轉錄組數據(ju)(ju)顯示(shi)(shi)，以胰(yi)(yi)管細(xi)(xi)胞(bao)為例，在(zai)PDAC-A中(zhong)，在(zai)腫瘤(liu)區域內富含APOL1高表達，即指示(shi)(shi)缺氧環境(jing)的(de)(de)胰(yi)(yi)管細(xi)(xi)胞(bao)以及末(mo)梢導管。在(zai)PDAC-B中(zhong)，則不(bu)含任(ren)何胰(yi)(yi)管細(xi)(xi)胞(bao) （圖4）。
圖(tu)4：胰管細胞亞群內在不同空間位(wei)置的分布(bu)比(bi)較
03、由于(yu)在前面scRNA-seq數(shu)據中發現(xian)PDAC-A的(de)(de)(de)兩個(ge)(ge)癌細(xi)(xi)(xi)胞亞(ya)(ya)群(qun)在遺傳上(shang)(shang)的(de)(de)(de)基因水(shui)平和轉錄水(shui)平上(shang)(shang)都是不同(tong)的(de)(de)(de)，因此為(wei)了(le)(le)更好的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)這兩個(ge)(ge)亞(ya)(ya)群(qun)，又額外取了(le)(le)2張(zhang)PDAC-A腫瘤不同(tong)區(qu)域的(de)(de)(de)組(zu)織(zhi)切片(pian)(pian)進行了(le)(le)ST實驗和分(fen)析(xi)，最后綜合三個(ge)(ge)PDAC-A組(zu)織(zhi)切片(pian)(pian)ST數(shu)據和scRNA-seq數(shu)據，MIA分(fen)析(xi)發現(xian)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)(xi)胞在癌細(xi)(xi)(xi)胞亞(ya)(ya)群(qun)1中富集程(cheng)(cheng)度高(gao)，在亞(ya)(ya)群(qun)2中富集程(cheng)(cheng)度則比較(jiao)低或者無富集。這種模式表明(ming)，癌細(xi)(xi)(xi)胞亞(ya)(ya)群(qun)1可(ke)能(neng)在組(zu)織(zhi)中引起特定的(de)(de)(de)基質反應，或者癌細(xi)(xi)(xi)胞亞(ya)(ya)群(qun)2可(ke)能(neng)與組(zu)織(zhi)中的(de)(de)(de)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)(xi)胞互斥（圖5）。
圖5：癌癥亞區域(yu)(yu)顯示出不同的(de)細胞(bao)類(lei)型和(he)(he)亞群富集（a–c，確定3個(ge)PDAC-A的(de)ST癌癥區域(yu)(yu)中(zhong)的(de)子(zi)區域(yu)(yu)。d，在PDAC-A中(zhong)鑒定的(de)癌癥的(de)子(zi)區域(yu)(yu)的(de)MIA圖以及在圖1和(he)(he)2中(zhong)鑒定的(de)細胞(bao)類(lei)型和(he)(he)細胞(bao)亞群。）
04、關(guan)于(yu)癌細(xi)胞(bao)的scRNA-seq數據的最(zui)新研究表(biao)(biao)明(ming)，多種癌癥類型中都有其獨特(te)的細(xi)胞(bao)狀態(tai)，因此(ci)作者考慮使(shi)用MIA方法(fa)將(jiang)癌細(xi)胞(bao)狀態(tai)映射到不同的空間(jian)組織區域并表(biao)(biao)征(zheng)它們與其他細(xi)胞(bao)類型的相(xiang)互(hu)作用。
為(wei)了(le)這一目(mu)的(de)，文中(zhong)加測了(le)一個(ge)PDAC的(de) scRNA-seq，綜(zong)合(he)分析scRNA-seq數(shu)(shu)據(ju)集后定義了(le)PDAC癌細胞之(zhi)(zhi)間的(de)三個(ge)基(ji)因(yin)表達模塊(kuai)，其中(zhong)應激(ji)響應模塊(kuai)對本研究尤為(wei)重要(yao)。之(zhi)(zhi)后通過(guo)來自6個(ge)患者的(de)樣本隊列的(de)10個(ge)ST實驗數(shu)(shu)據(ju)和MIA分析，發現了(le)應激(ji)模塊(kuai)高表達基(ji)因(yin)與炎(yan)性成纖維細胞之(zhi)(zhi)間的(de)強(qiang)富(fu)集關系(xi)。
最(zui)后通過(guo)結合數(shu)據庫中的(de)(de)一些(xie)之(zhi)(zhi)前的(de)(de)普通轉錄組數(shu)據發現(xian)，只有應(ying)(ying)激反應(ying)(ying)基因模(mo)塊(kuai)與(yu)(yu)(yu)炎性(xing)成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞特征顯著相關(guan)。作者追加了(le)免(mian)疫熒光(guang)實驗與(yu)(yu)(yu)免(mian)疫熒光(guang)切(qie)(qie)片(pian)相鄰的(de)(de)組織(zhi)切(qie)(qie)片(pian)的(de)(de)H＆E染色實驗，進一步證明炎性(xing)成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞與(yu)(yu)(yu)表(biao)達應(ying)(ying)激反應(ying)(ying)基因模(mo)塊(kuai)的(de)(de)癌細(xi)胞之(zhi)(zhi)間(jian)存在信(xin)號傳導(dao)關(guan)系(xi)。并通過(guo)對其他腫瘤的(de)(de)數(shu)據的(de)(de)MIA分析，驗證了(le)MIA方法(fa)在研究細(xi)胞群與(yu)(yu)(yu)空間(jian)受限結構之(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)關(guan)系(xi)上的(de)(de)實用(yong)性(xing)(圖6)。
圖(tu)6：繪(hui)制癌(ai)細(xi)胞狀態與其(qi)他細(xi)胞亞(ya)群之間(jian)的關(guan)系圖(tu)
小(xiao) 結
作者整體(ti)上就(jiu)(jiu)關注了兩個變量(liang)：空間區域和細胞類型。主(zhu)題思路就(jiu)(jiu)是(shi)固(gu)定一(yi)個變量(liang)，分析另一(yi)變量(liang)在(zai)該變量(liang)中的情況。
那么，除了上述兩個變(bian)量(liang)，是否存在其(qi)它變(bian)量(liang)，可(ke)以進(jin)行(xing)更(geng)全面的(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)(xi)，以解(jie)釋更(geng)精確(que)的(de)(de)生物學問題(ti)呢？答案(an)是肯定的(de)(de)。變(bian)量(liang)3可(ke)以是信號通(tong)路，變(bian)量(liang)4可(ke)以是存在受體和(he)配體互作關系(xi)的(de)(de)細胞間(jian)通(tong)訊等(deng)等(deng)。接下來的(de)(de)文獻解(jie)讀(du)專題(ti)，我(wo)們將通(tong)過(guo)另一(yi)(yi)(yi)篇science的(de)(de)文章，解(jie)讀(du)作者如何分(fen)(fen)析(xi)(xi)空間(jian)區域、細胞類(lei)型和(he)信號通(tong)路之間(jian)的(de)(de)關系(xi)，通(tong)過(guo)這樣(yang)的(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)(xi)，以幫(bang)助解(jie)決這樣(yang)的(de)(de)生物學問題(ti)：針對某一(yi)(yi)(yi)感興趣的(de)(de)基(ji)因(yin)，是否可(ke)以通(tong)過(guo)其(qi)空間(jian)表達(da)模式(shi)篩選到其(qi)共表達(da)的(de)(de)基(ji)因(yin)，研究參(can)與同一(yi)(yi)(yi)生物學過(guo)程的(de)(de)未知基(ji)因(yin)的(de)(de)生物學功(gong)能，進(jin)一(yi)(yi)(yi)步揭(jie)示感興趣生物學過(guo)程的(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)機(ji)制。感興趣的(de)(de)伙伴，請密切關注我(wo)們的(de)(de)后續更(geng)新。
升級版的(de)(de)10x Genomics Visium空間(jian)(jian)轉錄組技(ji)術(shu)相對(dui)于文(wen)章使(shi)用(yong)的(de)(de)早版的(de)(de)ST技(ji)術(shu)，單細胞(bao)分辨率上表(biao)現更加卓越，助力高分文(wen)章更是不(bu)在話下！想要研究空間(jian)(jian)表(biao)達情況(kuang)，要獲取無偏數(shu)據(ju)(ju)、甄選關鍵數(shu)據(ju)(ju)的(de)(de)你(ni)，趕緊(jin)行(xing)動起(qi)來吧(ba)!
文獻索引：
Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas[J]. Nat Biotechnol. 2020;38(3):333‐342. doi:10.1038/s41587-019-0392-8
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