2020-08-27
實(shi)時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）是(shi)一(yi)種(zhong)通過在PCR反應(ying)體系(xi)中引入一(yi)種(zhong)熒光物質，對(dui)(dui)PCR擴(kuo)增(zeng)反應(ying)中每一(yi)個(ge)循(xun)環(huan)產物的(de)(de)(de)(de)熒光信號進(jin)行(xing)實(shi)時檢測，以此對(dui)(dui)初始模板進(jin)行(xing)定量分析(xi)的(de)(de)(de)(de)實(shi)驗。相對(dui)(dui)定量指的(de)(de)(de)(de)是(shi)在待測樣本(ben)(ben)中目的(de)(de)(de)(de)序列相對(dui)(dui)于另一(yi)對(dui)(dui)照樣本(ben)(ben)的(de)(de)(de)(de)量的(de)(de)(de)(de)變化(hua)，比(bi)較對(dui)(dui)兩個(ge)或多個(ge)不同(tong)處(chu)理的(de)(de)(de)(de)樣本(ben)(ben)中的(de)(de)(de)(de)基(ji)因表達水平的(de)(de)(de)(de)高(gao)低變化(hua)，得到的(de)(de)(de)(de)結(jie)果是(shi)比(bi)率(lv)。
我們為什么要做相對定量呢？
其中(zhong)非常重(zhong)要(yao)的(de)一(yi)點就是對(dui)轉錄組測序的(de)驗證(zheng)。轉錄組測序是以數(shu)學(xue)模擬計算表達量，篩選的(de)的(de)基(ji)因(yin)比(bi)較多，一(yi)定(ding)程度上會有誤差，而(er)熒光定(ding)量是對(dui)特(te)異基(ji)因(yin)表達量的(de)檢測，特(te)異性相對(dui)更高(gao)。一(yi)個所(suo)謂(wei)數(shu)學(xue)方(fang)法(fa)(fa)，一(yi)個所(suo)謂(wei)實驗方(fang)法(fa)(fa)，干濕結合(he)，才能確(que)保分析結果的(de)可靠性。
另外，相對定量的研(yan)究范(fan)圍很廣泛，樣(yang)品類型(xing)可(ke)(ke)以(yi)是(shi)(shi)動物，植物，細胞，菌體，土(tu)壤(rang)甚至是(shi)(shi)病毒RNA。其中研(yan)究的RNA可(ke)(ke)以(yi)是(shi)(shi)編碼(ma)RNA，也可(ke)(ke)以(yi)是(shi)(shi)非編碼(ma)的RNA，如：長鏈非編碼(ma)RNA（lncRNA），miRNA，circRNA等，為基因(yin)研(yan)究提供更多類型(xing)。
一．表達水平驗證(zheng)：相對定量
1、實驗原理：
提取(qu)樣品中的總RNA,以其(qi)中的RNA作為模(mo)板(ban)，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄(lu)酶反轉錄(lu)成cDNA。再以cDNA為模(mo)板(ban)進行PCR擴增(zeng),而獲得目的基因(yin)或檢測(ce)基因(yin)表達(da)。
2、注意事項(xiang)：
（1）提取(qu)保證RNA的完整性
（2）引物(wu)(wu)設計(ji)：根(gen)(gen)據研究(jiu)的(de)目的(de)序列，設計(ji)引物(wu)(wu)；建議在正式(shi)上機(ji)之前(qian)進行(xing)引物(wu)(wu)調試，根(gen)(gen)據CT值范圍和(he)熔(rong)解曲(qu)線判斷引物(wu)(wu)是(shi)否有(you)引物(wu)(wu)二聚體或非特異性擴增，引物(wu)(wu)是(shi)否可(ke)用(yong)。
（3）內(nei)(nei)參(can)的選擇：選取一定的內(nei)(nei)參(can)基因，以(yi)(yi)(yi)除去不同標本在RNA產量、質量以(yi)(yi)(yi)及反轉錄效率(lv)上可能(neng)存在的差別，進行(xing)校(xiao)正和標準(zhun)化。不同的內(nei)(nei)參(can)在不同的組織(zhi)中表達(da)是有差異的；可以(yi)(yi)(yi)通過查找文獻或(huo)是選擇常用的多個內(nei)(nei)參(can)進行(xing)實驗驗證。
3、標記物(wu)：
熒光(guang)(guang)定量所使用(yong)的標記物可分為熒光(guang)(guang)染(ran)料(liao)和熒光(guang)(guang)探針，其(qi)中(zhong)比較常用(yong)的為SYBR Green I 染(ran)料(liao)和TaqMan探針。
SYBR Green I 是(shi)一種(zhong)結(jie)合(he)于所有雙(shuang)鏈(lian)(lian)DNA小溝的(de)(de)具有綠色激發(fa)(fa)波長的(de)(de)染料。游離的(de)(de)染料分子不發(fa)(fa)光(guang)，在新(xin)合(he)成鏈(lian)(lian)延伸過(guo)程中SYBR Green I與DNA雙(shuang)鏈(lian)(lian)結(jie)合(he)，發(fa)(fa)出熒(ying)光(guang)信號，一個反(fan)應發(fa)(fa)出的(de)(de)全部(bu)熒(ying)光(guang)信號與雙(shuang)鏈(lian)(lian)DNA量成比例(li)，隨(sui)擴增產物的(de)(de)增加而增加。
TaqMan探(tan)針(zhen)是單(dan)鏈DNA，兩(liang)段分別標記一(yi)(yi)個(ge)熒(ying)光報告基(ji)團和一(yi)(yi)個(ge)熒(ying)光淬滅基(ji)團，探(tan)針(zhen)完(wan)整(zheng)時，報告基(ji)團發射的(de)熒(ying)光被淬滅基(ji)團吸(xi)收；PCR擴(kuo)增時Taq酶發揮5’-3’外切酶活性，使(shi)兩(liang)種基(ji)團分離，從(cong)而熒(ying)光檢測系統可(ke)以(yi)接受到(dao)熒(ying)光信號(hao)，每擴(kuo)增一(yi)(yi)條DNA鏈，就有一(yi)(yi)個(ge)熒(ying)光分子形成，熒(ying)光信號(hao)的(de)累積和PCR產物形成是同(tong)步的(de)。
4、驗證(zheng)成功案例：
期(qi)刊(kan)：INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
影(ying)響因(yin)子：3.571
研究背(bei)景及意義
多(duo)形膠(jiao)質母(mu)細(xi)胞(bao)瘤(liu)(liu)(liu)（GBM）是(shi)最常見(jian)的(de)(de)(de)原發性惡性腦腫瘤(liu)(liu)(liu)，盡管近(jin)年(nian)來(lai)出現了多(duo)種治(zhi)療(liao)方法，例如手(shou)術(shu)，放療(liao)和(he)化學療(liao)法，但(dan)膠(jiao)質母(mu)細(xi)胞(bao)瘤(liu)(liu)(liu)患者的(de)(de)(de)總體(ti)生(sheng)存(cun)率并未發生(sheng)明顯變(bian)化。膠(jiao)質瘤(liu)(liu)(liu)干細(xi)胞(bao)（GSC），具(ju)有(you)自(zi)我更新的(de)(de)(de)能(neng)力和(he)多(duo)能(neng)性，并且可以誘導(dao)腫瘤(liu)(liu)(liu)發生(sheng)，對(dui)神(shen)經(jing)膠(jiao)質瘤(liu)(liu)(liu)研(yan)究日益重要。因此(ci)闡(chan)明控制(zhi)(zhi)GSC的(de)(de)(de)分子機(ji)制(zhi)(zhi)可能(neng)為開發針對(dui)GBM的(de)(de)(de)靶向治(zhi)療(liao)提(ti)供(gong)新的(de)(de)(de)信(xin)息。而之前的(de)(de)(de)一(yi)些研(yan)究已經(jing)表明，溴(xiu)結(jie)(jie)構域和(he)末(mo)端(duan)外域蛋白，尤其是(shi)含溴(xiu)結(jie)(jie)構域的(de)(de)(de)蛋白4（Brd4），可能(neng)是(shi)多(duo)種癌癥的(de)(de)(de)治(zhi)療(liao)靶標，但(dan)是(shi)目前尚不清楚(chu)Brd4在(zai)多(duo)形膠(jiao)質母(mu)細(xi)胞(bao)瘤(liu)(liu)(liu)（GBM）中的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)和(he)機(ji)制(zhi)(zhi)。本研(yan)究旨在(zai)探討(tao)Brd4和(he)溴(xiu)結(jie)(jie)構域抑(yi)制(zhi)(zhi)劑JQ1對(dui)神(shen)經(jing)膠(jiao)質瘤(liu)(liu)(liu)干細(xi)胞(bao)（GSC）的(de)(de)(de)抗腫瘤(liu)(liu)(liu)作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)潛在(zai)機(ji)制(zhi)(zhi)。
研究方法
RT-qPCR，蛋(dan)白質印跡(ji)(western blotting)，RNA-Seq測序和分析，免疫(yi)熒(ying)光和免疫(yi)組(zu)化實(shi)驗等。
驗證結(jie)果(guo)展示(shi)
RNG測序實驗中(zhong)，經JQ1處(chu)理(li)后的(de)(de)CSC2078基因上調和下調的(de)(de)基因表(biao)(biao)達(da)模式簇熱圖見圖A。對照組與JQ1處(chu)理(li)后CSC2078不同的(de)(de)基因數見圖B。對照，JQ1處(chu)理(li)組和siBrd4組中(zhong)PI3K，AKT和p-AKT（Ser473）的(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)印(yin)跡分(fen)析表(biao)(biao)達(da)結果(guo)(guo)見圖C和F。圖G和H則展示了p-AKT（Thr308）在JQ1處(chu)理(li)的(de)(de)CSC2078細胞(bao)中(zhong)的(de)(de)Western印(yin)跡分(fen)析表(biao)(biao)達(da)結果(guo)(guo)。最下面的(de)(de)KEGG富集分(fen)析氣泡圖展示了，JQ1處(chu)理(li)后，CSC2078的(de)(de)20個顯著富集的(de)(de)KEGG途徑。這些(xie)結果(guo)(guo)均表(biao)(biao)明PI3K / AKT信號通路在多形膠質(zhi)(zhi)母細胞(bao)瘤(liu)中(zhong)起重要作用。
KEGG通路富(fu)集分析顯示細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)周(zhou)期顯著富(fu)集。為了進一步研究Brd4在(zai)GSCs中調控細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)周(zhou)期進展的機制(zhi)，作(zuo)者采(cai)用RT-qPCR檢(jian)測了JQ1處理的CSC2078和TS543細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中與細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)周(zhou)期相關的基因c-Myc、cyclin D1、p21和p27。發(fa)現c-Myc和CyclinD1的mRNA表達水(shui)平明顯受到抑制(zhi)，而P21和P27的mRNA表達水(shui)平明顯上調。
由(you)于AKT可在(zai)多種癌癥(zheng)中(zhong)激活(huo)細(xi)胞(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)，作者(zhe)研(yan)究了(le)Brd4對GSCs凋(diao)亡(wang)基因的影響(xiang)。作者(zhe)利用(yong)RT-qPCR驗證了(le)JQ1和siBrd4對CSC2078和/或TS543細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)Bim、BAX、Bak、Bcl-2、Bcl-xl等PI3K/AKT信(xin)號通(tong)(tong)路(lu)(lu)中(zhong)重要凋(diao)亡(wang)基因的影響(xiang)。發現(xian)抑(yi)制血管內皮生(sheng)長因子(zi)/PI3K/AKT信(xin)號通(tong)(tong)路(lu)(lu)可導致膠質(zhi)瘤(liu)干細(xi)胞(bao)(bao)的細(xi)胞(bao)(bao)周(zhou)期阻滯；抑(yi)制VEGF/PI3K/AKT信(xin)號通(tong)(tong)路(lu)(lu)可誘(you)導GSCs凋(diao)亡(wang)。
研(yan)究結論
本研究旨在(zai)探討Brd4和(he)溴結構域抑制劑JQ1對神經膠質瘤干細胞（GSC）的(de)(de)(de)(de)抗腫(zhong)瘤作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)潛(qian)在(zai)機制。在(zai)體外，JQ1和(he)靶(ba)向(xiang)Brd4的(de)(de)(de)(de)小干擾RNA（siBrd4）抑制GSC的(de)(de)(de)(de)增殖和(he)自我更新。在(zai)體內，JQ1顯著抑制異種(zhong)移植GSCs腫(zhong)瘤的(de)(de)(de)(de)生長。RNA-seq分析表(biao)明(ming)，PI3K-AKT途(tu)徑在(zai)GBM中起(qi)重要(yao)作(zuo)用(yong)。通過JQ1處理GSC，血管內皮生長因子（VEGF）和(he)VEGF受(shou)體2的(de)(de)(de)(de)磷酸化被下(xia)調，從而(er)降低PI3K和(he)AKT活性。此外，用(yong)siBrd4或(huo)JQ1處理可通過激活參與凋亡的(de)(de)(de)(de)AKT下(xia)游靶(ba)基因來誘導(dao)凋亡。總之(zhi)，這些結果表(biao)明(ming)Brd4具(ju)有作(zuo)為治(zhi)療靶(ba)標的(de)(de)(de)(de)巨大(da)潛(qian)力，而(er)JQ1對GBM具(ju)有顯著的(de)(de)(de)(de)抗腫(zhong)瘤作(zuo)用(yong)，這可能(neng)是通過VEGF / PI3K / AKT信號傳導(dao)途(tu)徑介(jie)導(dao)的(de)(de)(de)(de)。
二(er)．新型冠狀病(bing)毒檢(jian)測（探針法(fa)應(ying)用）
新型冠(guan)狀病(bing)毒檢測提(ti)取(qu)病(bing)毒RNA，針對(dui)其(qi)基因組中開放讀碼框1ab (open reading frame 1ab, ORF1ab) 和核殼蛋白(nucleocapsid protein, N) 序列設計熒光(guang)探針引物。通過Ct值來判斷是否為(wei)陽性。
結果(guo)判定
陰(yin)性：無Ct值或Ct≥40。
陽性：Ct值(zhi)<37，可報告(gao)為陽性。
灰度區：Ct值在37-40之間，建議重復實驗(yan)，若重做(zuo)結果Ct值<40，擴增曲(qu)線(xian)有(you)明(ming)顯起(qi)峰，該樣本判斷為陽性(xing),否則(ze)為陰性(xing)。
在實驗室要確認一個(ge)病例為陽性(xing)，滿足(zu)以(yi)下條(tiao)件： 同(tong)一份標本中(zhong)新型(xing)冠(guan)狀病毒2個(ge)靶標（ORF1ab、N）特異性(xing)實時熒光RT-PCR檢測結果(guo)均為陽性(xing)。
