2020-09-03
在“困難樣(yang)本RNA提(ti)取的(de)技(ji)能你get到了嗎？”文章(zhang)中，我(wo)們(men)對RNA提(ti)取原則和原理做了簡(jian)單的(de)介紹，并對部分困難樣(yang)本進行了簡(jian)短(duan)的(de)總結和結果展示。
時間已(yi)經過去(qu)了兩個月，在此期間不斷(duan)有(you)新接觸RNA提取的(de)小伙伴反饋說，看(kan)不懂(dong)(dong)RNA的(de)質檢(jian)結果，不知如何對RNA質量進(jin)行評價，今天就帶大家一起看(kan)懂(dong)(dong)質檢(jian)圖(tu)。一般(ban)來說，RNA質檢(jian)圖(tu)有(you)兩種(zhong)，先是經瓊(qiong)脂糖凝膠電泳初步判斷(duan)樣本的(de)完整性，再是Aglient 2100 Bioanalyzer結果圖(tu)更為精確(que)的(de)判斷(duan)。
在看圖(tu)之(zhi)前(qian)，我們首(shou)先(xian)要了(le)解Total RNA中絕大多數是(shi)(shi)核(he)糖體RNA（rRNA），占(zhan)總(zong)RNA的(de)80%以上(shang)，mRNA在總(zong)RNA樣品(pin)中僅占(zhan)1-3%，所以我們質(zhi)檢(jian)圖(tu)中直(zhi)觀反映的(de)是(shi)(shi)rRNA的(de)檢(jian)測結果，依據(ju)rRNA的(de)質(zhi)量和(he)數量可以反映潛在的(de)mRNA質(zhi)量和(he)數量。達成了(le)這個共識，我們就(jiu)可以上(shang)圖(tu)說話了(le)。
一、瓊脂糖(tang)凝膠(jiao)電泳膠(jiao)圖主要需查看以下幾(ji)方(fang)面：
1.看目(mu)的(de)條(tiao)帶是否(fou)明亮清晰(xi)
2.看泳道內是否有降解彌散區
3.看膠孔處有無(wu)蛋白污(wu)染(ran)
4.看有無(wu)DNA污染(ran)
5.看有(you)無外源物種核酸(suan)污染
二、在看Aglient 2100 Bioanalyzer電泳圖前，我們(men)需要了解一下(xia)沉降(jiang)系數（S），即：反映(ying)生物大(da)分(fen)子(zi)在離心場中(zhong)向下(xia)沉降(jiang)速度的一個指(zhi)標，值越(yue)高(gao)，說明(ming)分(fen)子(zi)越(yue)大(da)。
s=v/(ω2?r)，通常1S=10-13秒
不同生(sheng)物之間rRNA的沉降系(xi)數存在較大區別，主要體現在以下三種(zhong)(zhong)組合：18s和(he)(he)28s rRNA（動物）；18s和(he)(he)25s rRNA（植物、低葉(xie)綠體含(han)量的組織(zhi)部位(wei)）；16s和(he)(he)23s rRNA（細菌(jun)）。同時，2100儀器檢測(ce)RNA時，有三種(zhong)(zhong)程(cheng)序(xu)對應(ying)(ying)這三種(zhong)(zhong)rRNA的組合。然(ran)而2100儀器在檢測(ce)RNA時，只會(hui)根據(ju)(ju)所選擇的程(cheng)序(xu)標(biao)注(zhu)出(chu)相應(ying)(ying)rRNA組合，不會(hui)根據(ju)(ju)片段大小進行(xing)調(diao)整(zheng)。所以在進行(xing)安捷倫2100檢測(ce)時，需要選擇正確的程(cheng)序(xu)進行(xing)電泳，不然(ran)細菌(jun)也可能會(hui)被(bei)標(biao)注(zhu)成18s和(he)(he)28s。
1、典型真(zhen)核(he)生物電泳圖
峰①為marker，25nt。
峰②為5s rRNA和5.8s rRNA，大小(xiao)分別為120nt和160nt。
峰③為18s rRNA，1900nt。
峰④為28s rRNA，4700nt。
峰⑤可能是前體RNA，濃度較低，距離28s rRNA較近。
這是(shi)典(dian)型(xing)真(zhen)(zhen)核生(sheng)物2100電(dian)泳圖中常見的(de)(de)5個峰(feng)，但不是(shi)所(suo)有(you)真(zhen)(zhen)核生(sheng)物都是(shi)這幾個峰(feng)，在最(zui)后的(de)(de)案(an)例展示(shi)中會(hui)簡短的(de)(de)再(zai)介紹一些特殊質檢圖。
2、典型植物葉片(pian)電泳(yong)圖(tu)中“c峰(feng)(feng)，d峰(feng)(feng)，e峰(feng)(feng)”則是葉綠體rRNA造成的。
3、典型原核生物電泳圖
了(le)解(jie)這些典(dian)型峰(feng)(feng)圖(tu)后(hou)，我們再簡單介紹下(xia)RNA完(wan)整(zheng)度(du)判定的金(jin)標(biao)準之一---RIN值(zhi)(zhi)。RIN值(zhi)(zhi)即為(wei)RNA完(wan)整(zheng)值(zhi)(zhi)（RNA integrity number），這一指標(biao)從(cong)(cong)整(zheng)體(ti)電泳圖(tu)出發，以(yi)消除RNA質量控制中(zhong)的個人解(jie)釋。RIN數值(zhi)(zhi)范圍為(wei)1-10，將生物(wu)總RNA質量分類，其中(zhong)1代表降(jiang)解(jie)最嚴重(zhong)的情況，10代表最完(wan)整(zheng)。通過這種方式，有助于解(jie)釋電泳圖(tu)，令樣品之間的比較成為(wei)可(ke)能，并確保實驗的重(zhong)復性。我們以(yi)真核哺乳動物(wu)為(wei)例，安捷(jie)倫2100質檢的樣本(ben)RIN值(zhi)(zhi)=2~10結果展示(shi)如下(xia)。從(cong)(cong)中(zhong)可(ke)以(yi)看(kan)出RIN值(zhi)(zhi)越(yue)大，基線(xian)越(yue)平整(zheng)、主峰(feng)(feng)越(yue)銳利。
三(san)：特殊案例(li)展示
1、昆(kun)蟲、軟(ruan)體動物
雖然也是真核生物，但一(yi)(yi)般基線平整即可，由(you)于28s rRNA存在(zai)“隱裂”現(xian)象(xiang)，產(chan)生了2個(ge)小片段：28sα和28sβ，二(er)者與18s重疊在(zai)一(yi)(yi)起形成了單峰趨勢(shi)。造成沒有28s或28s峰低的現(xian)象(xiang)。
2、細菌
由于(yu)微生物種類(lei)繁(fan)多，若(ruo)做(zuo)過物、化處理，23s/16s值會差異較大(da)。
3、動物(wu)細胞系(xi)
樣品出現(xian)(xian)下圖，18s rRNA和(he)28s rRNA下分別有雜峰，這(zhe)種多(duo)條帶現(xian)(xian)象，可(ke)能(neng)是微(wei)生物(wu)污(wu)染，也可(ke)能(neng)是線(xian)粒體(ti)RNA造成的，在一些褐色脂肪等富含線(xian)粒體(ti)的組織中(zhong)也會出現(xian)(xian)這(zhe)一現(xian)(xian)象。
4、宏轉錄組
存在多條帶現象。由于是(shi)宏樣品(pin)，物(wu)種組成不單一，樣品(pin)是(shi)否合(he)格需根據不同樣品(pin)特(te)性綜合(he)判斷。
綜上所述，在進行RNA質量評(ping)判時，RIN值不能(neng)作為RNA完整(zheng)性評(ping)判的唯(wei)一(yi)標(biao)準，還需結合基線是否(fou)平整(zheng)，峰型是否(fou)銳利，有無拖帶(dai)，以及(ji)物(wu)種和模擬電(dian)泳圖進行綜合評(ping)判。
RNA質量(liang)直接影響(xiang)文庫(ku)和測序(xu)質量(liang)，若完整度較差，則會(hui)(hui)存(cun)(cun)在文庫(ku)產量(liang)低、建庫(ku)失敗；測序(xu)數(shu)據(ju)隨機性差，可能會(hui)(hui)有偏好性；有效數(shu)據(ju)留(liu)(liu)存(cun)(cun)率(lv)低、mapping率(lv)低、基(ji)因覆蓋不均勻、rRNA殘留(liu)(liu)率(lv)高等風險(xian)，而對于Small RNA測序(xu)，則存(cun)(cun)在無目的條(tiao)帶、目的條(tiao)帶弱或(huo)雜帶多；有效數(shu)據(ju)留(liu)(liu)存(cun)(cun)率(lv)低，reads分布異(yi)常等風險(xian)。本著(zhu)對客(ke)戶項目負責的原(yuan)則，派森諾有著(zhu)嚴謹的RNA提取和結果判定規范，助力各(ge)位(wei)老師項目高質量(liang)完成~
