2020-09-08
哈嘍，又見面(mian)啦！BSA項目得到(dao)了(le)候(hou)選區(qu)間，后(hou)續(xu)如(ru)何縮(suo)小候(hou)選區(qu)間，如(ru)何對(dui)候(hou)選基因進行(xing)驗(yan)證呢？
今天小編就選取了(le)幾(ji)篇典型(xing)的(de)BSA文章為大(da)家(jia)進行驗證(zheng)方法的(de)總結。
該文獻研(yan)究的(de)是(shi)玉米(mi)籽粒大小的(de)性狀，該項目bsa選(xuan)取了(le)極端表型(xing)植株共100株（野生型(xing)與突(tu)變(bian)(bian)型(xing)混(hun)池各(ge)50株）進行測序(xu)，采用△snp-Index進行分析，最終定位區間(jian)為7號(hao)染色體(ti)上0~2M的(de)區間(jian)，包(bao)含64個(ge)基(ji)因。通過(guo)分析突(tu)變(bian)(bian)類型(xing)，找到了(le)8號(hao)染色體(ti)有一個(ge)snp（在Zm00001d018624的(de)第8個(ge)外顯(xian)子(zi)上）發(fa)現突(tu)變(bian)(bian)，導致提前出現終止密碼子(zi)，轉錄水平顯(xian)著降低。并通過(guo)構建突(tu)變(bian)(bian)體(ti)的(de)BC1F1群體(ti)，對候選(xuan)區間(jian)進行了(le)進一步縮小與確認。
候選基因(yin)已經(jing)確(que)定了(le)，如何驗證(zheng)呢?本文采用了(le)多種方式對(dui)這(zhe)一(yi)基因(yin)進(jin)行(xing)了(le)驗證(zheng)。
驗證方法1：突變(bian)數據庫反向篩(shai)選
通過在(zai)(zai)突(tu)(tu)(tu)變(bian)數據庫(ku)的(de)(de)(de)(de)篩選，找到(dao)了2個(ge)產生(sheng)相同性狀的(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)變(bian)類(lei)型(xing)的(de)(de)(de)(de)突(tu)(tu)(tu)變(bian)株(zhu)，將這(zhe)些基因(yin)克(ke)隆，其(qi)中(zhong)vks1-2等位(wei)基因(yin)是由(you)Zm00001d018624第12個(ge)內含子的(de)(de)(de)(de)剪接受體位(wei)點突(tu)(tu)(tu)變(bian)引起的(de)(de)(de)(de)，導致該內含子的(de)(de)(de)(de)RNA剪接缺陷。vks1-3等位(wei)基因(yin)來自于Zm00001d018624的(de)(de)(de)(de)59未翻譯(yi)區(UTR)的(de)(de)(de)(de)Mu插入。將vks1-2自花授(shou)粉(fen)后子代發生(sheng)性狀分離(li)，種(zhong)(zhong)子中(zhong)觀察(cha)到(dao)vks1-1的(de)(de)(de)(de)類(lei)似表(biao)型(xing)。vks1-3種(zhong)(zhong)子也遠小于野(ye)生(sheng)型(xing)(W22)，但在(zai)(zai)純合vks1-3穗上沒有明(ming)(ming)顯的(de)(de)(de)(de)種(zhong)(zhong)子大(da)小變(bian)異，說明(ming)(ming)vks1表(biao)型(xing)部分依賴于遺傳背景(jing)。為了進(jin)行(xing)等位(wei)性檢(jian)驗(yan)，我們在(zai)(zai)純合子vks1-1和雜(za)合子vks1-2/+植株(zhu)間進(jin)行(xing)雜(za)交。得到(dao)的(de)(de)(de)(de)穗與(yu)vks1和野(ye)生(sheng)型(xing)種(zhong)(zhong)子的(de)(de)(de)(de)分離(li)比例接近1:1。
驗(yan)證(zheng)方法(fa)2：CRISPR/CAS9編輯技術
我們(men)利(li)用CRISPR/CAS9基(ji)因(yin)編輯技術，產生更多的(de)vks1零等位基(ji)因(yin)。gRNA被設計用于靶向Zm00001d018624的(de)第8個(ge)外顯子(zi)。得到3個(ge)C缺(que)失、T插入和127-bp缺(que)失的(de)獨立轉(zhuan)基(ji)因(yin)株系，分別命(ming)名為vks1-4、vks1-5和vks1-6。自花授粉的(de)vks1-4/+穗(作為這些CRISPR/ cas9誘導的(de)無突變體的(de)代表(biao))也分離出了不同大小的(de)小種子(zi)，如圖invks1-1和vks1-2所示(shi)。因(yin)此，Zm00001d018624是(shi)vks1表(biao)型的(de)基(ji)因(yin)。
本文中，作者(zhe)結(jie)合傳(chuan)統(tong)基因定(ding)位方法和BSA法，利用155個(ge)F6代重組自交系個(ge)體，定(ding)位了IL52的霜霉病(bing)與白粉病(bing)抗(kang)性候選(xuan)基因，并(bing)揭示了兩者(zhe)之間的連鎖關系。
從(cong)155個(ge)(ge)RILS中(zhong)選取(qu)16株(zhu)(zhu)抗病，20株(zhu)(zhu)感病材(cai)料混(hun)池測序后(hou)，做BSA定(ding)(ding)位(wei)分(fen)析(xi)，結果定(ding)(ding)位(wei)到5號(hao)染(ran)色體23.21-25.70 Mb的(de)2.49M區(qu)間(jian)(jian)內(nei)，區(qu)間(jian)(jian)內(nei)包(bao)含(han)27個(ge)(ge)△SNPindex = 1的(de)SNP位(wei)點，其中(zhong)非同義(yi)突變位(wei)點3個(ge)(ge)，3’UTR位(wei)點1個(ge)(ge)，分(fen)布在4個(ge)(ge)基因上(shang)。
通過連(lian)鎖圖譜和RILS表型數據，PM基因(yin)被定位在InDel73 (23.68 Mb) 和InDel82 (24.94 Mb)之(zhi)間，與(yu)BSA結果相符。后基于(yu)BSA結果開發的Indel、SNP、SSR分子標記與(yu)193個(ge)F2個(ge)體表型綜合分析(xi)，pm基因(yin)被定位到17ID185和17ID211之(zhi)間, 遺(yi)傳(chuan)距(ju)(ju)離 0.5 cM，物理距(ju)(ju)離468 kb (24,550,703-25,018,946 bp)，區間內包含3個(ge)基因(yin)。同時發現(xian)基因(yin)Csa5M622830.1的3’UTR上(shang)的 SNP6，與(yu)PM完全連(lian)鎖。
該文獻BSA定(ding)位未取得較(jiao)好的區間(jian)定(ding)位結果(guo)，但(dan)卻為我們提(ti)供了一種新的候選基因確定(ding)的思路。
通過SNP和(he)indel call，在(zai)MF-和(he)MSbulk之間確(que)定了(le)2,594,935個(ge)SNP和(he)405,428個(ge)indel。為了(le)繪制雄性不(bu)育(yu)圖譜(pu)，應用ED算法測量等位基(ji)(ji)(ji)因(yin)分離，并根(gen)據兩大(da)群(qun)體間的(de)snp和(he)indels確(que)定連接基(ji)(ji)(ji)因(yin)組位點。通常，ED在(zai)統計(ji)上(shang)顯著的(de)峰(feng)值(zhi)被(bei)認為是一(yi)個(ge)候選范圍。然(ran)而，在(zai)我們的(de)研(yan)究中(zhong)，12條(tiao)染色(se)體都沒(mei)有發(fa)現明顯的(de)峰(feng)。為了(le)克(ke)服上(shang)述(shu)問(wen)題，我們采用了(le)更嚴格(ge)的(de)過濾，規則如下:(1)ED值(zhi)必須大(da)于(yu)0.5;(2) SNP必須引(yin)起非同義(yi)突變;(3) indel必須導致移碼(ma)突變。最(zui)后，9個(ge)snp和(he)4個(ge)indels通過篩選，發(fa)現它們位于(yu)6條(tiao)染色(se)體上(shang)的(de)12個(ge)注釋基(ji)(ji)(ji)因(yin)上(shang)，被(bei)認為是mcs-1位點的(de)候選基(ji)(ji)(ji)因(yin)。
候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)(yin)選(xuan)定了，該(gai)文獻老師采用的(de)(de)是(shi)根據已(yi)有文獻報(bao)道的(de)(de)相關基(ji)因(yin)(yin)，鎖定了最終的(de)(de)候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)(yin)，為了驗(yan)證(zheng)(zheng)這一(yi)基(ji)因(yin)(yin)，老師開(kai)發了indel標記，利用兩個群體NILs群體驗(yan)證(zheng)(zheng)了indel-12標記與雄性不育性狀的(de)(de)共混關系(xi)，結果(guo)如下圖(tu)所(suo)示，表(biao)明在驗(yan)證(zheng)(zheng)群體中，msc-1基(ji)因(yin)(yin)組呈現(xian)完(wan)全的(de)(de)共分離(li)現(xian)象，表(biao)明Capana02g002096可能(neng)是(shi)msc-1基(ji)因(yin)(yin)座的(de)(de)強大(da)候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)(yin)。
篇幅有限，小編就不多贅述了，總結下來。
當候選區間較大時，縮小候選區間的方法如下：
1、構(gou)建遺傳圖譜，結合表型數據，采用QTL分(fen)析進行定位，一般選取與BSA分(fen)析的(de)交集作為候選區間；
2、開發(fa)分子標記(ji)，通(tong)過驗證群體(ti)性狀與分子標記(ji)的一(yi)致性縮(suo)小候(hou)選區(qu)間；
3、結合已經報道的(de)性(xing)狀相關基(ji)因或者相關突變體庫，鎖定候選基(ji)因；
4、結合轉錄組的(de)相關(guan)基(ji)因表達(da)水平分析選取(qu)具(ju)有明顯表達(da)水平差異的(de)基(ji)因作為(wei)候(hou)選基(ji)因。
候選基因主要的驗證方法有：
1、將候選SNPs轉化為CAPs或者indel等標記進行驗證；
2、基于轉(zhuan)錄(lu)組數(shu)據的差(cha)(cha)異表(biao)(biao)達(da)分析，看(kan)基因是否有顯著表(biao)(biao)達(da)差(cha)(cha)異；
3、功能(neng)缺失型實驗驗證(zheng)，如CRISPR、基(ji)因敲除，過表達等；
4、RT-PCR驗證候選基因的(de)表(biao)達。
好啦(la)(la)，BSA定位(wei)后續(xu)分析方法總(zong)結就到這(zhe)啦(la)(la)，不知道老師們(men)有沒有學(xue)會呢？其(qi)實從以上(shang)文(wen)章(zhang)大家應該也能發現，BSA項(xiang)目中，定位(wei)得到候(hou)選區間只是(shi)(shi)(shi)故(gu)事的(de)(de)(de)開始，候(hou)選基因的(de)(de)(de)確定及基因功能的(de)(de)(de)驗證才是(shi)(shi)(shi)文(wen)章(zhang)畫龍(long)點睛的(de)(de)(de)那一筆，研究者們(men)每一篇文(wen)章(zhang)的(de)(de)(de)背(bei)后，都是(shi)(shi)(shi)固有思維與大開腦洞的(de)(de)(de)碰撞(zhuang)，也許這(zhe)就是(shi)(shi)(shi)科學(xue)的(de)(de)(de)魅力吧！
參(can)考(kao)文獻：
1. Yongcai Huang, Haihai Wang, Xing Huang et al. Maize VKS1 Regulates Mitosis and Cytokinesis During Early Endosperm Development. Plant Cell. 2019 , 31(6):1238-1256. doi: 10.1105/tpc.18.00966.
2. Kaijing Zhang, Xing Wang, Wenwei Zhu et al. Complete resistance to powdery mildew and partial resistance to downy mildew in a Cucumis hystrix introgression line of cucumber were controlled by a co-localized locus. Theor Appl Genet. 2018 , 131(10):2229-2243.doi: 10.1007/s00122-018-3150-2
3. Qing Cheng, Peng Wang, Jinqiu Liu et al. Identification of candidate genes underlying genic male-sterile msc-1 locus via genome resequencing in Capsicum annuum L. Theor Appl Genet, 2018, 131(9):1861-1872. doi: 10.1007/s00122-018-3119-1.
