2020-09-15
2020年(nian)1月(yue)《nature communications》期刊(kan)發表了(le)(le)(le)一篇題為“Integrating multiple genomic technologies to investigate an outbreak of carbapenemase-producing Enterobacter hormaechei”的(de)文章，該文章整合了(le)(le)(le)多個平臺的(de)測序技術（Illumina、PacBio、Nanopore）調查產碳青(qing)霉烯腸桿菌的(de)疫(yi)情爆發情況，為疫(yi)情提供了(le)(le)(le)深入(ru)分(fen)析(xi)。 研究(jiu)背景 碳青(qing)(qing)霉(mei)烯抗(kang)生(sheng)素已(yi)成為治療多藥(yao)耐(nai)藥(yao)(MDR)革蘭(lan)氏陰性(xing)(xing)菌(jun)(jun)引起的嚴重感染的主要(yao)藥(yao)物(wu)，該抗(kang)生(sheng)素使用量的增加(jia)已(yi)導致碳青(qing)(qing)霉(mei)烯類藥(yao)物(wu)產(chan)生(sheng)耐(nai)藥(yao)性(xing)(xing)，以及產(chan)碳青(qing)(qing)霉(mei)烯酶的腸(chang)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)科(CPE)和(he)耐(nai)碳青(qing)(qing)霉(mei)烯酶的腸(chang)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)科(CRE)出現，其中(zhong)包括常見的腸(chang)菌(jun)(jun)，如大腸(chang)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)、肺炎克雷(lei)伯菌(jun)(jun)和(he)腸(chang)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)屬。 2005年以前，99.9%的(de)腸桿菌對(dui)碳(tan)青霉烯敏感。然而，隨著CRE分離株(zhu)的(de)增加，現在世界衛(wei)生組(zu)織所有衛(wei)生區域(yu)都報(bao)道了該類(lei)微生物。據報(bao)道，CRE感染(ran)的(de)死(si)亡率高達48%，對(dui)用粘菌素代(dai)替碳(tan)青霉烯類(lei)的(de)最(zui)后一線抗生素也出現了耐藥性。 腸桿(gan)菌(jun)科細菌(jun)對碳青(qing)(qing)霉(mei)烯類耐藥(yao)是(shi)通(tong)過一系列機制發(fa)生的(de)，最(zui)令(ling)人關注的(de)是(shi)碳青(qing)(qing)霉(mei)烯酶(mei)編碼基因的(de)獲得，最(zui)常見的(de)是(shi)通(tong)過移動(dong)遺傳(chuan)元件(MGEs)的(de)轉移，如質粒，偶(ou)爾攜帶(dai)多種與其他耐藥(yao)決定因素共位的(de)多個(ge)β-內酰胺酶(mei)，使這些菌(jun)株呈MDR或廣泛耐藥(yao)性(xing)（XDR）。 在過(guo)去的(de)十年里(li)，全基因組測序(WGS)變得(de)更容易獲得(de)和(he)負擔得(de)起(qi)，導致其(qi)在許多(duo)領域的(de)應用增加(jia)，包括(kuo)臨床(chuang)微(wei)生物學。使(shi)用WGS來表征臨床(chuang)相關(guan)細菌(jun)(jun)的(de)主要(yao)特征之一是(shi)它能夠在單(dan)個核苷酸的(de)分辨率上提(ti)供(gong)菌(jun)(jun)株的(de)親緣(yuan)關(guan)系。WGS已被用于了解(jie)醫院環境(jing)下的(de)傳(chuan)(chuan)播情(qing)況(kuang)，而不(bu)僅(jin)僅(jin)是(shi)使(shi)用傳(chuan)(chuan)統的(de)診斷方(fang)法(fa)來確定(ding)傳(chuan)(chuan)播情(qing)況(kuang)。然(ran)而這(zhe)些研(yan)究(jiu)中(zhong)很多(duo)是(shi)回顧性的(de)，并且主要(yao)是(shi)采用單(dan)一測序技術進行(xing)(xing)進行(xing)(xing)的(de)，鮮少采取(qu)多(duo)種測序技術來研(yan)究(jiu)疫情(qing)的(de)傳(chuan)(chuan)播情(qing)況(kuang)。 材料與方法(fa) 1、實驗材(cai)料(liao)與方法 （1）從(cong)3位(wei)燒傷患(huan)者的不同部位(wei)采取10份(fen)樣本，周邊醫院取7份(fen)blaIMP-4陽性的菌株、進行(xing)基因(yin)組(zu)測序與傳統培養； （2）選擇ICU病(bing)房中收(shou)集到50個拭子和水的樣(yang)本(ben)以及(ji)燒傷病(bing)房等疫(yi)情爆發無關的的環境樣(yang)本(ben)進(jin)行宏基(ji)因組(zu)測序與傳統培(pei)養。 2、測(ce)序及組裝方法 （1）二代測序平臺(tai)：Illumina Hiseq、NextSeq、MiSeq； （2）三(san)代(dai)測(ce)序平臺：Pacbio、Nanopore MinION （3）組(zu)裝(zhuang)方法：Spades（v3.6.0和v3.11.1）、Canu (v1.3)、SMRT Analysis suite (version 2.3.0)； 3、比較基因組分析 基(ji)因(yin)核(he)心基(ji)因(yin)組SNP進化樹構建；MLST分(fen)型；質粒分(fen)型；ANI分(fen)析；比(bi)較基(ji)因(yin)組圈圖。 實(shi)驗結果與分析(xi) 1、臨床實驗 2015年年中(zhong)，RBWH ICU收治了(le)(le)3名(ming)(ming)燒傷患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)。患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)1和(he)(he)2在同一天(tian)入(ru)院(yuan)，入(ru)院(yuan)后(hou)，兩(liang)(liang)名(ming)(ming)患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)均出現耐碳(tan)(tan)青(qing)(qing)霉烯(xi)感(gan)染(ran)。患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)1取兩(liang)(liang)份樣(yang)本(ben)（氣管(guan)插(cha)管(guan)和(he)(he)尿(niao)液），患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)2取四(si)份樣(yang)本(ben)（氣管(guan)插(cha)管(guan)、尿(niao)液和(he)(he)血）。患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)3于患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)1、2出院(yuan)37天(tian)后(hou)入(ru)院(yuan)，患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)3也因對碳(tan)(tan)青(qing)(qing)霉烯(xi)耐藥的(de)(de)陰溝腸桿菌(jun)感(gan)染(ran)而感(gan)染(ran)，并從氣管(guan)插(cha)管(guan)、血液和(he)(he)傷口部(bu)位(wei)提取了(le)(le)四(si)份樣(yang)本(ben)。經(jing)過抗生素和(he)(he)抗真菌(jun)治療，患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)在入(ru)ICU的(de)(de)第(di)47天(tian)得(de)到緩解(jie)。在確(que)認三位(wei)患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)(zhe)感(gan)染(ran)了(le)(le)產(chan)blaIMP-4的(de)(de)Enterobacter hormaechei后(hou)，對所有10個分離株進行(xing)了(le)(le)測序和(he)(he)基因組學分析。 對得到(dao)的分(fen)離株進(jin)行藥(yao)敏(min)實驗，發現除MS7889（在第36天(tian)從患者2的尿(niao)液中分(fen)離）外(wai)，其他(ta)分(fen)離株對頭(tou)孢曲松(song)、頭(tou)孢他(ta)啶(ding)、替卡(ka)西林(lin)-克拉(la)維酸、哌拉(la)西林(lin)-他(ta)唑巴(ba)坦、美(mei)羅培(pei)南、慶大霉素(su)和磺胺(an)甲惡唑均耐藥(yao)，MS7889則(ze)對碳(tan)青霉烯類完全敏(min)感。 2、Illumina、Pacbio、Nanopore測序 對10個分離(li)株進(jin)行(xing)WGS測序，結果表明所(suo)有(you)的分離(li)株都(dou)為ST90類型、都(dou)含有(you)IncHI2質粒，大(da)多(duo)數都(dou)有(you)相(xiang)(xiang)同(tong)的抗性(xing)基因(yin)，包(bao)括100%相(xiang)(xiang)同(tong)的blaIMP-4基因(yin)（MS7889除外）。與數據庫進(jin)行(xing)比對發現，分離(li)株與2013年從被火燒傷的病人身上分離(li)的ST90型菌株Ecl1近(jin)緣，并且表現出相(xiang)(xiang)同(tong)的耐(nai)藥基因(yin)圖(tu)譜。 以Ecl1為參(can)考基因組進行SNP分(fen)(fen)(fen)析，發(fa)現RBWH分(fen)(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)的差異小于5個核心(xin)SNP，這與祖先的進化(hua)關系(xi)一致。其中患(huan)者(zhe)3缺失了一個原(yuan)噬(shi)菌體，但是患(huan)者(zhe)1的兩個分(fen)(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)和患(huan)者(zhe)3的兩個分(fen)(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)在(zai)核心(xin)基因組水平上無法區分(fen)(fen)(fen)。Ecl1與這些(xie)分(fen)(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)非常密切相關，不同的只有(you)一個核心(xin)SNP。來自患(huan)者(zhe)2的所有(you)四(si)個分(fen)(fen)(fen)離株(zhu)(zhu)均含有(you)特(te)定的SNP缺失，排除了患(huan)者(zhe)2至(zhi)患(huan)者(zhe)3的傳(chuan)播。 為了(le)確定周圍醫院(yuan)產IMP腸桿(gan)菌(jun)(jun)的情況(kuang)，對7個(ge)產blaIMP-4的分(fen)離株(zhu)(zhu)進行測序，MLST和SNP分(fen)析沒有發現其(qi)與Ecl1之間有聯系(與Ecl1親緣關系最近的菌(jun)(jun)株(zhu)(zhu)也有50000個(ge)SNP)。雖(sui)然不(bu)是克隆(long)株(zhu)(zhu)，但所有腸桿(gan)菌(jun)(jun)科分(fen)離株(zhu)(zhu)都具有非(fei)常相似的抗生素抗性基(ji)(ji)因譜(pu)，這(zhe)可能通過MGEs(例如整合(he)子和/或質(zhi)粒(li))進行橫向基(ji)(ji)因轉移。WGS分(fen)析顯示，本研究中的所有18個(ge)大腸桿(gan)菌(jun)(jun)分(fen)離株(zhu)(zhu)，都含有一個(ge)IncHI2質(zhi)粒(li)和一個(ge)相同的BLAIMP-4基(ji)(ji)因，這(zhe)強烈(lie)表明醫院(yuan)腸桿(gan)菌(jun)(jun)科之間BLAIMP-4的質(zhi)粒(li)介(jie)導循(xun)環。 對具有(you)代表性(xing)的(de)MS7884分離物進行(xing)Pacbio測序，得到了4.8M左(zuo)右的(de)染色體和兩個質粒(li)(li)(li)。質粒(li)(li)(li)pMS7884A長330,060bp，攜帶多個抗性(xing)操縱子以(yi)及一個~55kb的(de)MDR區(qu)域(yu)。MDR區(qu)域(yu)被發(fa)現含有(you)兩個1類整(zheng)合子(In809，In37)以(yi)及其他幾個抗生素耐藥(yao)基因。將(jiang)這一多藥(yao)耐藥(yao)區(qu)域(yu)與公開的(de)基因組進行(xing)比較，發(fa)現與2012年從澳大(da)(da)利亞悉尼的(de)陰(yin)溝腸桿菌分離出的(de)pEl1573非常相(xiang)似。而pMS788B為不可分型質粒(li)(li)(li)，大(da)(da)小為126,208bp，不含有(you)抗生素抗性(xing)基因。 除MS7889外，Illumina測(ce)序的(de)(de)另外17個分離株中都(dou)存在相同的(de)(de)質(zhi)粒；由(you)于兩個幾(ji)乎相同的(de)(de)氨基(ji)(ji)糖苷類耐藥基(ji)(ji)因(yin)之間(jian)的(de)(de)同源重組(zu)，MDR質(zhi)粒(包括blaIMP-4)中丟失(shi)了約(yue)34 kb區域。值得(de)注意的(de)(de)是，在15%的(de)(de)病(bing)例中，MS7884在美(mei)羅培(pei)南(nan)缺陷培(pei)養(yang)基(ji)(ji)中，會導致(zhi)BlaIMp-4基(ji)(ji)因(yin)或整個質(zhi)粒的(de)(de)丟失(shi)。 為了更好的(de)了解(jie)MS14449與2015年(nian)的(de)腸桿菌分離株之間(jian)的(de)關系構建進化(hua)樹(shu)，根據進化(hua)樹(shu)來(lai)MS14449不屬(shu)于ST90分型（后(hou)續Illumina測序發現該(gai)菌株屬(shu)于新(xin)的(de)ST175分型）。MS14449測序后(hou)與pMS7884A進行核苷酸比(bi)對，表明MS14449可(ke)能存在(zai)(zai)一個(ge)高度相似(si)的(de)質(zhi)粒(li)，但是pMS7884A與MS14449相比(bi)可(ke)能存在(zai)(zai)部分MDR基因的(de)缺失。 3、宏基因組測(ce)序(xu) 使用傳統(tong)(tong)的(de)培養(yang)方法對(dui)(dui)醫院環境(jing)進行檢測(ce)，并未發(fa)現ST90型環境(jing)來源的(de)腸(chang)桿菌。2018年(nian)5月，從ICU病房(fang)中(zhong)收(shou)集到(dao)50個拭(shi)子和(he)(he)(he)水的(de)樣(yang)本以及燒(shao)傷病房(fang)等疫情爆(bao)發(fa)無關(guan)的(de)的(de)環境(jing)樣(yang)本進行測(ce)序和(he)(he)(he)傳統(tong)(tong)培養(yang)。傳統(tong)(tong)培養(yang)檢測(ce)到(dao)Klebsiella oxytoca, E. cloacae complex 和(he)(he)(he)Leclercia adecarboxylata，Illumina測(ce)序確(que)定這(zhe)些分離株(zhu)(zhu)與疫情無關(guan)，但是(shi)這(zhe)4株(zhu)(zhu)分離株(zhu)(zhu)中(zhong)有3株(zhu)(zhu)上含有blaIMP-4基(ji)因，進一步(bu)比(bi)對(dui)(dui)發(fa)現其對(dui)(dui)應的(de)IncHI2質粒與pMS7884A高度一致(zhi)。 宏基(ji)因(yin)組組裝結果與(yu)參考基(ji)因(yin)組Enterobacter hormaechei在(zai)染色體和(he)質粒水平上有很高的相(xiang)似性(xing)，ANI平均在(zai)93%-97%之間。MLST分析也能(neng)檢測(ce)到一個幾乎相(xiang)同的等位(wei)基(ji)因(yin)ST90，抗性(xing)基(ji)因(yin)篩查也發現了blaIMP-4基(ji)因(yin),和(he)IncHI2型質粒的存在(zai)。 結(jie)論(lun)與討論(lun) 1、通(tong)過(guo)Illumina測(ce)序(xu)(xu)，發(fa)現(xian)所有的產碳青霉(mei)烯的腸桿菌(jun)分離(li)株序(xu)(xu)列都(dou)為ST90，且幾乎(hu)相(xiang)同；與公開可獲得的數據(ju)進(jin)行比較，所有爆發(fa)的分離(li)株都(dou)可以(yi)與該病在2013年一株分離(li)株相(xiang)聯系起來，表(biao)明(ming)該醫院存在環境來源(yuan)； 2、使用(yong)Pacbio測序(xu)，發現了不同醫院產IMP-4菌株中的IncHI2質粒上blaIMP-4基因的完整背景； 3、對醫院管道(dao)中的樣本進行(xing)宏基因(yin)組測序(xu)發現(xian)了ST90型(xing)腸桿菌(jun)和IncHI2質(zhi)粒(li)； 4、Nanopore測序結合(he)Illumina測序迅速解決了(le)后續分離物與最初爆發的真實關系(xi)。 雖(sui)然(ran)在WGS的(de)成本和可(ke)用性方(fang)面有(you)了顯(xian)著(zhu)改善，但(dan)將這些進展納(na)入常規(gui)臨(lin)床微(wei)生(sheng)物學(xue)仍(reng)是一個挑戰。這幾項研究表明，WGS能夠在菌株(zhu)之間提供(gong)最(zui)佳(jia)區分，從而有(you)助于告知對暴發或醫院(yuan)內感(gan)染的(de)反應(ying)。在此(ci)，本文證(zheng)明，綜合WGS方(fang)法可(ke)以幫助快速確(que)定危重護理環境中的(de)疫情，特(te)別是傳播途徑(jing)。 文章索(suo)引：Roberts L W , Harris P N A , Forde B M , et al. Integrating multiple genomic technologies to investigate an outbreak of carbapenemase-producing Enterobacter hormaechei[J]. Nature Communications, 2020, 11(1). 點擊閱讀全文(wen)：//www.nature.com/articles/s41467-019-14139-5#citeas
