2020-09-17
16S rDNA是編(bian)碼原核生物(wu)核糖體(ti)小(xiao)(xiao)亞(ya)基(ji)的(de)基(ji)因，長度約為1542bp，其分(fen)子大小(xiao)(xiao)適中，突變(bian)(bian)率小(xiao)(xiao)，是細菌系統分(fen)類(lei)學研究中最(zui)常用和最(zui)有用的(de)標志。16S rRNA基(ji)因序(xu)列包括9個可(ke)變(bian)(bian)區(qu)（Variable region）和10個保(bao)守(shou)區(qu)（Constant region），保(bao)守(shou)區(qu)序(xu)列反(fan)映了物(wu)種(zhong)間的(de)親緣關系， 而可(ke)變(bian)(bian)區(qu)則能體(ti)現物(wu)種(zhong)間的(de)差(cha)異(yi)(yi)。通(tong)過檢測(ce)16S rDNA可(ke)變(bian)(bian)區(qu)的(de)序(xu)列變(bian)(bian)異(yi)(yi)和豐(feng)度，可(ke)了解環(huan)境(jing)樣(yang)品中群落多樣(yang)性信息，在微生物(wu)分(fen)類(lei)鑒定、微生態研究等方面起著重要的(de)作用。
圖(tu)1：16S rDNA結構圖(tu)
我們知(zhi)道，細菌(jun)16S全長(chang)一共有V1-V9九個(ge)區(qu)(qu)，受illumina測序(xu)技術限(xian)制(zhi)，不管(guan)選擇一個(ge)還是兩個(ge)V區(qu)(qu)，我們在進行物種注釋時都僅能注釋到(dao)屬水平(ping)，而無法將其準確注釋到(dao)物種水平(ping)。Sanger測序(xu)雖能接近全長(chang)，但通(tong)量(liang)低(di)，且成本高，不適用群體復雜(za)的宏樣本。
受Sanger和NGS各自的測序劣勢限制，同時兼具長讀長和高通量優勢的三代單分子測序技術應運而生，下面小編總結了三代Pacbio測序平臺在16S全長研究應用中的幾點優勢：
1、高(gao)準確(que)率：16S全長(chang)在Pacbio測(ce)序中選用CCS（circular consensus sequencing）模式，產生(sheng)的reads通過CCS算法需(xu)要至(zhi)少三輪讀(du)取，準確(que)率在0.99以上(shang)。
2、更準確的(de)物(wu)種分類，更多(duo)的(de)物(wu)種鑒定(ding)。
3、能精確定位到“種”水平。
全長16S測序(xu)流程
全長(chang)16S生信分(fen)析(xi)流程
案例解(jie)析
標題：利用三代測序技術對微生物組實現“高分辨率”解析
該(gai)研(yan)究于2016年發表于微生態領域頂級期(qi)刊《The ISME Journal》上（最(zui)新影響因子：9.328）。
原(yuan)文鏈接：
//www.nature.com/articles/ismej2015249
研究背景
過去十多年中，隨著(zhu)短讀(du)長(chang)、高(gao)通量二代(dai)測序(xu)的(de)(de)(de)(de)興起(qi)，以(yi)16S rRNA基(ji)因部分(fen)可變區序(xu)列(lie)為目標的(de)(de)(de)(de)分(fen)析方法(fa)，逐漸(jian)替代(dai)了基(ji)于(yu)rRNA基(ji)因全(quan)長(chang)克(ke)隆文庫的(de)(de)(de)(de)一(yi)代(dai)Sanger測序(xu)法(fa)，使我們能對菌群組成進行深(shen)度定量解析。然而(er)，由于(yu)二代(dai)測序(xu)讀(du)長(chang)短的(de)(de)(de)(de)特(te)性，我們無法(fa)對測得物種進行精確的(de)(de)(de)(de)分(fen)類鑒定，從而(er)限制了我們對菌群代(dai)謝功(gong)能的(de)(de)(de)(de)深(shen)入(ru)理解。隨著(zhu)三代(dai)SMRT測序(xu)技(ji)術(shu)的(de)(de)(de)(de)出(chu)現，我們有望從根(gen)本(ben)上(shang)解決這一(yi)瓶頸，實現對rRNA基(ji)因全(quan)長(chang)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)高(gao)通量精準測序(xu)。
研究方法
樣(yang)本來(lai)源：23種細菌和3種古菌組成的人工菌群，以及取自湖水(shui)的天然微生物群落樣(yang)本
測(ce)序平臺(tai)：PacBio RS II（16S rRNA基因(yin)全長）+Illumina MiSeq（16S rRNA基因(yin)V4區(qu)）
對兩種(zhong)測(ce)(ce)序(xu)平臺的測(ce)(ce)序(xu)結(jie)果進行多樣性組(zu)成譜(pu)分析，并通過(guo)計算機模擬，比較(jiao)16S rRNA基因(yin)全長序(xu)列(lie)(lie)和單(dan)V區序(xu)列(lie)(lie)的物種(zhong)分辨(bian)能(neng)力。
研究結(jie)果
根據(ju)兩種(zhong)(zhong)平(ping)(ping)臺的(de)測(ce)序(xu)結(jie)果，門(men)水(shui)平(ping)(ping)的(de)菌群(qun)組成較為(wei)相似，但在(zai)更(geng)精(jing)細的(de)水(shui)平(ping)(ping)存(cun)在(zai)差(cha)異(yi)。同時，三代測(ce)序(xu)的(de)結(jie)果顯著降低了物(wu)種(zhong)(zhong)分類信(xin)息的(de)不確定(ding)性。計算機模擬的(de)結(jie)果也(ye)表(biao)明，短讀長的(de)單V區測(ce)序(xu)可(ke)能(neng)嚴重低估某些(xie)特定(ding)類群(qun)的(de)微生物(wu)，比如水(shui)體樣(yang)本中參與(yu)氮循環和甲烷代謝的(de)物(wu)種(zhong)(zhong)。因(yin)此，基于(yu)三代測(ce)序(xu)的(de)菌群(qun)多樣(yang)性組成譜分析能(neng)極(ji)大地提升物(wu)種(zhong)(zhong)分類鑒定(ding)的(de)精(jing)確性，實現(xian)“高分辨(bian)率”檢測(ce)的(de)同時，也(ye)為(wei)深入闡釋菌群(qun)的(de)代謝功能(neng)奠定(ding)了基礎。
兩(liang)種測(ce)序(xu)平臺測(ce)序(xu)結(jie)果(guo)的(de)整體(ti)比較(jiao)。兩(liang)者菌(jun)群的(de)整體(ti)結(jie)構較(jiao)為相(xiang)似，但當菌(jun)群復雜(za)程度增加時（底圖子圖），兩(liang)者的(de)檢測(ce)結(jie)果(guo)有(you)所(suo)差異。PhyloTags，三(san)代PacBio RS II測(ce)序(xu)結(jie)果(guo)；iTags，Illumina MiSeq測(ce)序(xu)結(jie)果(guo)。
16S rRNA基因(yin)(yin)(yin)各(ge)V區(qu)的序(xu)列保守(shou)性(xing)并不一(yi)致(zhi)，因(yin)(yin)(yin)而基于(yu)16S rRNA基因(yin)(yin)(yin)全長(chang)序(xu)列的三代測序(xu)，可(ke)以更全面地反(fan)映物(wu)種(zhong)的種(zhong)屬(shu)信(xin)息。a圖，以Salmonella屬(shu)為代表，全長(chang)序(xu)列的種(zhong)間差異達到(dao)97.4%，但V4區(qu)高(gao)度保守(shou)，二代測序(xu)結果將(jiang)低估(gu)該(gai)物(wu)種(zhong)的多樣(yang)性(xing)；b圖，某(mou)些物(wu)種(zhong)在V4區(qu)的多樣(yang)性(xing)可(ke)能高(gao)于(yu)其他V區(qu)，因(yin)(yin)(yin)而二代測序(xu)結果將(jiang)高(gao)估(gu)相關物(wu)種(zhong)的多樣(yang)性(xing)。
兩(liang)種測(ce)序(xu)(xu)平臺(tai)測(ce)序(xu)(xu)結果的精細比較。a圖(tu)，三代測(ce)序(xu)(xu)的結果顯著降低了物種分類信息(xi)的不確定性；b圖(tu)，二(er)代單V區測(ce)序(xu)(xu)結果可能會(hui)嚴重(zhong)低估某些(xie)特定微生物類群的含量（以方(fang)框標記(ji)）。
研究結論
綜上(shang)所述(shu)，運(yun)用三代測序技術進(jin)行(xing)微生物組(zu)研究，將顯著提升菌群多樣性(xing)組(zu)成譜解析的精準性(xing)和全(quan)面性(xing)。
參考文獻(xian)
Singer, E., Bushnell, B., Coleman-Derr, D., Bowman, B., Bowers, R.M., Levy, A., Gies, E.A., Cheng, J.-F., Copeland, A., Klenk, H.-P., et al. (2016). High-resolution phylogenetic microbial community profiling. ISME J 10, 2020-2032.
