2020-09-22
最近有很多老師咨詢(xun)關(guan)于植物(wu)性(xing)別決定(ding)機制(zhi)研(yan)究的(de)(de)項目，今天(tian)小(xiao)編就結合南(nan)京林業大學尹老師團隊發表在BioRxiv的(de)(de)研(yan)究成果（//doi.org/10.1101/2020.03.15.993022），給大家進行文獻解讀和該類型項目研(yan)究思(si)路(lu)的(de)(de)總結。
摘(zhai)要(yao)
植(zhi)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)(xing)別(bie)決(jue)定系統和(he)性(xing)(xing)(xing)染色體相對(dui)來(lai)說在(zai)演化(hua)(hua)史比(bi)較(jiao)“年輕”。本(ben)文(wen)中(zhong)，作(zuo)者發現一(yi)個(ge)完(wan)全雌雄(xiong)異株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)林木美洲黑楊（Populus deltoides）處于(yu)性(xing)(xing)(xing)染色體形成的(de)(de)(de)(de)(de)早(zao)期階(jie)段(duan)，其(qi)中(zhong)雌株(zhu)(zhu)和(he)雄(xiong)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)(xing)別(bie)在(zai)遺傳上分別(bie)由(you)兩(liang)小(xiao)段(duan)與X或Y物(wu)理連(lian)鎖的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列所(suo)決(jue)定。有趣的(de)(de)(de)(de)(de)是，有兩(liang)個(ge)Y基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在(zai)對(dui)應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)X染色體上丟(diu)失了(le)。其(qi)中(zhong)一(yi)個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)產生的(de)(de)(de)(de)(de)siRNA通過RNA指導的(de)(de)(de)(de)(de)DNA甲基(ji)(ji)(ji)(ji)化(hua)(hua)和(he)siRNA引導的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA剪切來(lai)阻斷(duan)一(yi)個(ge)對(dui)于(yu)雌性(xing)(xing)(xing)結構(gou)發育(yu)至關重要的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)，從(cong)而達(da)到抑(yi)制雌性(xing)(xing)(xing)結構(gou)發育(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用。而另外一(yi)個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)能夠產生長鏈非(fei)編碼RNA（lncRNA）轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)本(ben)，這些lncRNA轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)本(ben)在(zai)雄(xiong)性(xing)(xing)(xing)中(zhong)會消耗一(yi)些特異作(zuo)用于(yu)雄(xiong)蕊發育(yu)抑(yi)制的(de)(de)(de)(de)(de)miRNAs。擬(ni)南芥中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)遺傳轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)試(shi)驗顯示這兩(liang)個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)能夠分布獨立(li)并且(qie)拮抗地影響雌蕊和(he)雄(xiong)蕊的(de)(de)(de)(de)(de)發育(yu)。因(yin)(yin)此(ci)，楊樹中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)(xing)別(bie)決(jue)定系統為開花植(zhi)物(wu)雌雄(xiong)異株(zhu)(zhu)早(zao)期演化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)研究提供(gong)了(le)一(yi)個(ge)平臺，其(qi)中(zhong)兩(liang)個(ge)具有聯合效應(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)(xing)別(bie)決(jue)定基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)比(bi)較(jiao)偏(pian)向于(yu)緊密連(lian)鎖。
項目背景(jing)
● 性別決定是(shi)植(zhi)物(wu)繁殖、發(fa)育與進化中(zhong)的一個(ge)有趣的研究方向。大多數開花植(zhi)物(wu)都是(shi)“兩性同(tong)體棵(ke)”，只有約10%的被(bei)子植(zhi)物(wu)能開單性花（雄花和(he)雌花在同(tong)一植(zhi)株(zhu)(zhu)（雌雄同(tong)株(zhu)(zhu)），或不同(tong)植(zhi)株(zhu)(zhu)（雌雄異株(zhu)(zhu)））。
● 雌雄(xiong)(xiong)(xiong)異株（dioecism）在被子植物(wu)不同支(zhi)系中獨立演化(hua)出多次，近年來在蘆筍(sun)（asparagus；雌性(xing)抑制(zhi)基因SOFF，雄(xiong)(xiong)(xiong)性(xing)促進基因aspTDF1）和(he)獼猴桃(tao)（kiwifruit；雌性(xing)抑制(zhi)基因SyGI，雄(xiong)(xiong)(xiong)性(xing)促進基因FrBy）中的(de)研究顯示，該繁(fan)育(yu)系統由兩(liang)(liang)性(xing)同體演化(hua)而來，其中Y染色體上完(wan)全連鎖的(de)兩(liang)(liang)個基因相互(hu)(hu)獨立、卻又(you)互(hu)(hu)相拮抗地作用(yong)于雌性(xing)和(he)雄(xiong)(xiong)(xiong)性(xing)發育(yu)。
● 除了雙基(ji)因(yin)系統之外，單(dan)基(ji)因(yin)控(kong)制(zhi)的雌雄(xiong)異株(zhu)也(ye)存在(zai)。在(zai)玉(yu)米（maize）和甜瓜（melon）中(zhong)，人(ren)為設(she)計出了該(gai)系統；而在(zai)柿子(zi)（persimmon）中(zhong)則是(shi)天(tian)然演化(hua)出了單(dan)基(ji)因(yin)控(kong)制(zhi)系統，柿子(zi)Y染色體上(shang)的假基(ji)因(yin)OGI通過抑制(zhi)常染色體上(shang)的旁系同源基(ji)因(yin)MeGI來作用于雄(xiong)花的特化(hua)。
實驗材料與方法
1、樣品選取：
1）Denovo：選取一株雌(ci)性P. deltoides及其(qi)雄性F2代個體進行從頭測序(xu)；
2）美(mei)洲黑楊GWAS：選取無親緣(yuan)關系雌株(zhu)49， 雄(xiong)株(zhu)46；
3）轉錄組測(ce)序：采集9個時期（6月(yue)(yue)~1月(yue)(yue)），采集花(hua)蕾部分進行轉錄組測(ce)序，每個時期3個重復（其(qi)中花(hua)藥發育早(zao)期（T1~T5）,采集的帶鱗片花(hua)芽(ya)，（T5~T9）采集去鱗片花(hua)芽(ya)）。
2、方法(fa)思路：
結果(guo)解讀
01、性別決定(ding)位點的定(ding)位和X、Y單倍型的重建(jian)
圖1美洲黑楊第19號染色體單(dan)倍體的重建
本文對一株雌性美洲黑楊以及其雄性子代進行了測序、組裝，雌株基因組大小431Mb，contig N50長1.4Mb；雄性基因組大小414Mb，contig N50長2.8Mb。利用SSR標記將性別決定位點定位到了19號染色體上端粒與N362標記之間的299kb基因組區域上，作者將其定義為性別連鎖區域（SLR ，sex-linked region）（Fig 1A）。另外，由于雄株是雌株的直系后代，因此雄株XY染色體的X是來自于雌株。作者進一步通過SNP分型，分別構建了雄株的X和Y單倍體（Fig 1B）。通過比較X和Y單倍型的SLR區域，作者發現Y染色體上存在一長一短兩個半合子區段，并通過PCR驗證了雄性中的半合子區段（Fig 1C、D）。
02、性別(bie)決定(ding)基因的鑒定(ding)
為了進一步(bu)的(de)鑒定性別(bie)決定基因，作者(zhe)基于49棵(ke)雌(ci)株(zhu)和46棵(ke)雄株(zhu)的(de)SNP數據進行了GWAS分析(xi)。
圖2 美洲黑楊性別GWAS分析的曼哈頓圖
利用(yong)雌(ci)株基因組(zu)作(zuo)為(wei)(wei)reference，作(zuo)者鑒(jian)定到(dao)了(le)435個(ge)SNP存在(zai)(zai)雌(ci)株純合(he)(he)、雄(xiong)株雜合(he)(he)的(de)(de)(de)基因型（SEMS），其(qi)中(zhong)315個(ge)SEMSs存在(zai)(zai)于三個(ge)SLR基因中(zhong)，分(fen)別(bie)是(shi)TCP、CLC和MET1（Fig 2A）。剩余的(de)(de)(de)SEMSs中(zhong)，78個(ge)位于一(yi)個(ge)叫做FERR基因位點上(shang)，該位點雖(sui)然同(tong)在(zai)(zai)19號染色(se)體(ti)上(shang)，但是(shi)屬于擬常染色(se)體(ti)（pseudo-autosomal）。至于剩下的(de)(de)(de)那些SEMSs均分(fen)布于常染色(se)體(ti)上(shang)。由于使用(yong)的(de)(de)(de)是(shi)雌(ci)性(xing)基因組(zu)作(zuo)為(wei)(wei)參考(kao)序(xu)列，可能會(hui)將來自Y連鎖區(qu)(qu)域(yu)的(de)(de)(de)read比對到(dao)X染色(se)體(ti)的(de)(de)(de)其(qi)它同(tong)源區(qu)(qu)域(yu)，從而造成假(jia)陽性(xing)的(de)(de)(de)SEMS。通過進一(yi)步(bu)利用(yong)SLR-Y作(zuo)為(wei)(wei)參考(kao)基因組(zu)，發現所有常染色(se)體(ti)上(shang)SEMS全部消除不見(jian)（Fig 2C）。另(ling)外，采用(yong)read coverage，mapping基因組(zu)上(shang)只在(zai)(zai)一(yi)個(ge)性(xing)別(bie)中(zhong)存在(zai)(zai)，而在(zai)(zai)另(ling)一(yi)個(ge)性(xing)別(bie)中(zhong)確(que)實的(de)(de)(de)基因組(zu)區(qu)(qu)域(yu)，結果發現以SLR-X作(zuo)為(wei)(wei)reference沒有鑒(jian)定到(dao)任何結果，而以SLR-Y作(zuo)為(wei)(wei)reference則鑒(jian)定到(dao)了(le)與之前一(yi)致的(de)(de)(de)半合(he)(he)子(zi)區(qu)(qu)段區(qu)(qu)域(yu)（Fig 2D）。而在(zai)(zai)其(qi)中(zhong)長(chang)的(de)(de)(de)半合(he)(he)子(zi)區(qu)(qu)段含有兩個(ge)基因，分(fen)別(bie)是(shi)FERR-R和MmS。
03、候選性別決定基因的表達
圖(tu)3 基因表達水平的比較
為了進一步確認上文所鑒定到的(de)候選基(ji)因，作者定量了這些基(ji)因在楊樹雌花和(he)雄(xiong)花發育過程中(zhong)的(de)表達水平(ping)。結(jie)果(guo)發現，TCP、CLC和(he)MET1基(ji)因在雌、雄(xiong)花發育過程中(zhong)均(jun)有表達，且沒(mei)有明顯的(de)偏向(xiang)性。而FERR只在雌花中(zhong)表達，FERR-R和(he)MmS基(ji)因只在雄(xiong)花中(zhong)表達。由于FERR基(ji)因處于擬常(chang)染色(se)體區(qu)(qu)域，而MmS則處于Y染色(se)體的(de)半(ban)合子區(qu)(qu)域，因此作者推測這兩個基(ji)因可能作用于楊樹的(de)性別決定。
04、FERR-R是一種雌(ci)性化抑制基(ji)因(yin)，產(chan)生siRNAs抑制FERR的功能
序(xu)(xu)列比對顯(xian)(xian)示FERR-R基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)與FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)序(xu)(xu)列相似性較高，在啟動(dong)子和外(wai)顯(xian)(xian)子的(de)(de)(de)(de)(de)大(da)部分區域(yu)存(cun)在序(xu)(xu)列同(tong)源（Fig 4A）。鏈特異性lncRNA和small RNA測(ce)序(xu)(xu)數(shu)據顯(xian)(xian)示，FERR-R基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)轉錄成一條長的(de)(de)(de)(de)(de)轉錄本(ben)，然后會形成小(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)干擾RNAs，即siRNAs（Fig 4B）。并且(qie)由FERR-R基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)產生的(de)(de)(de)(de)(de)siRNA可以(yi)指導FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)啟動(dong)子、5’-UTR以(yi)及第(di)一個外(wai)顯(xian)(xian)子和內含子上(shang)(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)DNA甲(jia)基(ji)(ji)化(hua)（Fig 4B）。亞硫酸氫鹽測(ce)序(xu)(xu)顯(xian)(xian)示FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)位點這(zhe)些區域(yu)上(shang)(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)DNA甲(jia)基(ji)(ji)化(hua)只是特異性的(de)(de)(de)(de)(de)在雄株中(zhong)存(cun)在（Fig 4B）。此外(wai)，FERR-R基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)產生的(de)(de)(de)(de)(de)siRNA還能(neng)夠靶向(xiang)FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)三個外(wai)顯(xian)(xian)子，表(biao)(biao)明FERR-R基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)可能(neng)還會參與siRNA引導的(de)(de)(de)(de)(de)FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)轉錄本(ben)剪切，作(zuo)者進(jin)一步(bu)通過瞬(shun)間表(biao)(biao)達試(shi)驗驗證了(le)這(zhe)一點（Fig 4C）。結合(he)上(shang)(shang)文對于FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在雌雄花中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達分析，以(yi)及在擬南芥(jie)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)過表(biao)(biao)達試(shi)驗（Fig 5A），作(zuo)者推測(ce)FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)作(zuo)用(yong)于促進(jin)雌性器官發育，而(er)雄株中(zhong)特有的(de)(de)(de)(de)(de)FERR-R基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)則作(zuo)用(yong)于FERR基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)功能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)抑制。
圖4 FERR-R基因起源及及其功能分析
05、MmS基因(yin)位點降(jiang)低miRNA水平，促進雄性
生(sheng)信分析(xi)顯示MmS的(de)轉錄本能夠結合多個miRNA（Fig 6A）。qRT顯示MmS基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在雄花不同發(fa)(fa)育時期持續表(biao)達(da)（Fig 3C）。作者(zhe)推測MmS基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)通(tong)過(guo)結合多個miRNAs，從而使得雄株(zhu)(zhu)中的(de)miRNAs相比于雌株(zhu)(zhu)中的(de)更少(shao)，也阻斷了雄株(zhu)(zhu)中這(zhe)些(xie)miRNA對(dui)于其靶(ba)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)抑制，而這(zhe)些(xie)靶(ba)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)可能作用于促進雄性器官(guan)發(fa)(fa)育。楊樹MmS基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在擬南(nan)(nan)芥(jie)中的(de)過(guo)表(biao)達(da)試驗顯示其能夠增加擬南(nan)(nan)芥(jie)的(de)雄蕊，但不影響雌蕊的(de)發(fa)(fa)育（Fig 5B）
圖5 轉擬南芥的表型
06、性別決定模(mo)型(xing)推斷
綜上，作者(zhe)提出了美洲黑楊中的性別(bie)決定模(mo)型。結果(guo)如下：
結(jie)果(guo)與討論(lun)
1. 楊樹雌(ci)(ci)雄(xiong)異(yi)型(xing)發育過程中可能有(you)許多基因起作用，但FERR-R和MmS似乎(hu)是(shi)決定楊樹雌(ci)(ci)雄(xiong)異(yi)型(xing)的上游基因；
2. 包(bao)括哺乳動物(wu)、鳥(niao)類和(he)果蠅(ying)在內的(de)許多Y染(ran)色(se)體的(de)一(yi)個(ge)顯(xian)著特征(zheng)是沒有(you)(you)交叉，有(you)(you)時會導致出現在X染(ran)色(se)體(以及(ji)Y染(ran)色(se)體祖先)上的(de)大量基(ji)(ji)因(yin)(yin)丟失，這一(yi)過程被(bei)稱(cheng)為(wei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)退化。每(mei)周黑(hei)楊的(de)性別(bie)決定(ding)基(ji)(ji)因(yin)(yin)似乎也在一(yi)個(ge)非(fei)重(zhong)組區(qu)域(yu)，但它在物(wu)理上比剛才提到的(de)動物(wu)案例要(yao)小(xiao)得多，甚至比獼猴桃和(he)蘆(lu)筍中(zhong)的(de)小(xiao)區(qu)域(yu)還(huan)要(yao)小(xiao)。我們的(de)研(yan)究結果揭示(shi)了(le)美洲黑(hei)楊兩(liang)個(ge)性別(bie)決定(ding)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)區(qu)域(yu)不會重(zhong)組的(de)原因(yin)(yin)，同時也說明了(le)有(you)(you)兩(liang)種(zhong)不同的(de)途(tu)徑可以阻止植(zhi)物(wu)Y-和(he)X-連(lian)接區(qu)域(yu)之(zhi)間的(de)重(zhong)組。
3. 該研(yan)究(jiu)表明(ming)，在(zai)(zai)(zai)楊樹中，FERR-R的(de)功能涉及到RNAi和DNA甲基化過程，而MmS是第一個報道(dao)在(zai)(zai)(zai)雌雄異(yi)株植物(wu)中觸發性別分離的(de)miRNA海(hai)綿基因。由于許多miRNA家(jia)族在(zai)(zai)(zai)所有(you)主(zhu)要植物(wu)譜系中進化保守，因此MmS基因可能對楊樹以外的(de)植物(wu)雄性器官(guan)的(de)形成具有(you)重要意(yi)義；
4. 在世界上許多地區，楊樹是主要的景觀，也是重要的纖維和燃料的商業來源。性別決定基因的獨立功能使我們可以通過基因編輯分別阻斷雌性楊樹和雄性楊樹的雌蕊和雄蕊發育。本研究為減少有性繁殖的能量消耗，解決雌性楊樹的種子毛和雄性楊樹的花粉對空氣造成的嚴重污染提供了修飾基因。
該研究不管從實驗設計還是結果驗證都給了我們對于植物性別決定機制的研究提供了一種很好的思路。如果大家也對植物性別研究有興趣，歡迎和我們一起探討，可在文末留言或者郵件交流（genome_support@doudin.cn）。下面是動植物產品線的產品類型，如果對其他產品比較感興趣的，也可以郵箱反饋我們，后續我們一一為大家安排
