2020-09-23
前(qian)有“”，后有“”，今天我(wo)們迎(ying)來(lai)了第(di)三(san)，希望通過連續三(san)期(qi)的問答方(fang)式，讓更多(duo)的人對代(dai)謝組研究的了解更深入一步。
Q1、代謝組檢(jian)測(ce)閾值是(shi)多(duo)(duo)少，或者說檢(jian)測(ce)代謝物的最(zui)低含(han)量(liang)是(shi)多(duo)(duo)少？
不(bu)(bu)(bu)同檢測平(ping)臺的(de)靈敏(min)度是不(bu)(bu)(bu)同的(de)，LC-MS靈敏(min)度最高(gao)，可達到(dao)fM級。但是，由(you)于(yu)不(bu)(bu)(bu)同物(wu)質(zhi)(zhi)自身的(de)化(hua)學性質(zhi)(zhi)不(bu)(bu)(bu)同，從而導致質(zhi)(zhi)譜的(de)離子化(hua)效率、信號(hao)響(xiang)應(ying)強度都會有很大(da)的(de)差異。所以，物(wu)質(zhi)(zhi)在代(dai)謝組研究檢測中(zhong)的(de)靈敏(min)度跟自身的(de)性質(zhi)(zhi)有關。因此，相同含量的(de)不(bu)(bu)(bu)同物(wu)質(zhi)(zhi)，可能(neng)一個(ge)能(neng)檢測到(dao)，另(ling)一個(ge)檢測不(bu)(bu)(bu)到(dao)。
Q2、為什么通(tong)過(guo)其他(ta)技術手段(duan)檢測物(wu)質A的(de)含量明(ming)顯(xian)(xian)多于物(wu)質B，但是在代謝(xie)組數據中，物(wu)質B的(de)信號強度明(ming)顯(xian)(xian)大于物(wu)質A的(de)信號強度？
誠如上一(yi)題(ti)所說(shuo)，不(bu)同(tong)(tong)物(wu)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)理化(hua)性質(zhi)(zhi)(zhi)是不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)，各自具有不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)分子(zi)結(jie)構和性質(zhi)(zhi)(zhi)基團(tuan)，因(yin)此不(bu)同(tong)(tong)物(wu)質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)質(zhi)(zhi)(zhi)譜(pu)離子(zi)化(hua)效率、信(xin)號響應強度等(deng)方面都可能(neng)是有較(jiao)大的(de)(de)差異(yi)的(de)(de)，最后體現為不(bu)同(tong)(tong)物(wu)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)譜(pu)檢測效率有所區別。因(yin)此，代(dai)謝組數據僅適(shi)用(yong)于(yu)同(tong)(tong)一(yi)物(wu)質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)不(bu)同(tong)(tong)狀態(tai)、不(bu)同(tong)(tong)組別間的(de)(de)比(bi)較(jiao)，不(bu)適(shi)用(yong)于(yu)同(tong)(tong)一(yi)樣本內部不(bu)同(tong)(tong)物(wu)質(zhi)(zhi)(zhi)之間量的(de)(de)比(bi)較(jiao)。
Q3、實驗可收集到(dao)的樣本(ben)量低于檢測公司的要(yao)求，是否還可以研(yan)究代謝組？
代(dai)謝(xie)(xie)組研究在(zai)上(shang)(shang)機(ji)檢(jian)測前，需要對(dui)樣(yang)本進行前處理，進行代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)(wu)(wu)提(ti)取，如果(guo)起始樣(yang)本量就較(jiao)(jiao)少(shao)，那么提(ti)取后代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)(wu)(wu)的(de)量也會很少(shao)，上(shang)(shang)機(ji)溶液(ye)中每種代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)(wu)(wu)的(de)相(xiang)對(dui)豐度則較(jiao)(jiao)低(di)，對(dui)于質(zhi)譜(pu)檢(jian)測來說，相(xiang)對(dui)豐度極(ji)低(di)的(de)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)則可能檢(jian)測不到(dao)(dao)，最終影響到(dao)(dao)檢(jian)測到(dao)(dao)的(de)代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)(wu)(wu)數量。但是相(xiang)對(dui)豐度較(jiao)(jiao)高的(de)，被成(cheng)功檢(jian)測到(dao)(dao)的(de)代(dai)謝(xie)(xie)物(wu)(wu)(wu)的(de)結果(guo)還是有(you)一定參考意(yi)義的(de)。
Q4、是否可以專門(men)針對(dui)XX物(wu)質(zhi)進(jin)行靶向檢測？
首先需(xu)要對(dui)XX物(wu)質(zhi)進(jin)行(xing)評估(gu)，是(shi)(shi)否(fou)具有相關(guan)的文(wen)獻通過質(zhi)譜(pu)平臺成(cheng)功檢(jian)測(ce)(ce)(ce)該(gai)物(wu)質(zhi)，即(ji)方(fang)法(fa)學問題。其次是(shi)(shi)該(gai)類型項目即(ji)使(shi)文(wen)獻有相應(ying)的方(fang)法(fa)學，還需(xu)去查詢(xun)是(shi)(shi)否(fou)有可購買的標(biao)(biao)準品(pin)及其貨期。待收到標(biao)(biao)準品(pin)后，即(ji)可進(jin)行(xing)方(fang)法(fa)學試驗，此過程可能需(xu)要不斷地(di)調整參數，優化條件(jian)，直至(zhi)實際的方(fang)法(fa)學可以檢(jian)測(ce)(ce)(ce)出標(biao)(biao)準品(pin)完整合格譜(pu)圖。最后才(cai)是(shi)(shi)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)待測(ce)(ce)(ce)樣本。如果需(xu)要進(jin)行(xing)絕對(dui)定量(liang)，還需(xu)使(shi)用標(biao)(biao)準品(pin)進(jin)行(xing)質(zhi)譜(pu)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)構建標(biao)(biao)準曲線。
Q5、是否可以專(zhuan)門針對(dui)XX，YY，ZZ物質(zhi)進行靶向檢測？
除了上(shang)述第四個(ge)問(wen)(wen)題的(de)答案中(zhong)所需(xu)(xu)要(yao)考(kao)慮的(de)問(wen)(wen)題以(yi)外，還(huan)有(you)(you)一點需(xu)(xu)要(yao)明確(que)，即(ji)不同的(de)物(wu)(wu)質的(de)本身化(hua)學性質是不同的(de)，對應的(de)適合掃(sao)(sao)描模(mo)式（正(zheng)離子掃(sao)(sao)描模(mo)式/負離子掃(sao)(sao)描模(mo)式）可(ke)(ke)能不同，其次(ci)是不同的(de)物(wu)(wu)質可(ke)(ke)能存(cun)在保(bao)留(liu)時間接近(jin)或者互相(xiang)干擾影響的(de)情況(kuang)，導(dao)致他們(men)不能在相(xiang)同的(de)檢(jian)(jian)測(ce)條件下同時檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)。所以(yi)可(ke)(ke)根據第一次(ci)的(de)結果進一步決定(ding)是否(fou)需(xu)(xu)要(yao)部分(fen)(fen)物(wu)(wu)質單獨檢(jian)(jian)測(ce)。總體上(shang)來說，多次(ci)上(shang)機分(fen)(fen)別檢(jian)(jian)測(ce)成本比多種物(wu)(wu)質一次(ci)上(shang)機檢(jian)(jian)測(ce)會有(you)(you)所提高。
Q6、GC-MS檢(jian)測和固相微(wei)萃取GC-MS檢(jian)測的區(qu)別？
GC-MS檢(jian)測一(yi)般是指(zhi)使(shi)用氣相色譜儀和質(zhi)(zhi)譜儀聯用檢(jian)測代謝物(wu)。氣相色譜僅適用于沸(fei)點(dian)低(di)(di)、熱(re)穩定性好(hao)的(de)小分(fen)子(zi)物(wu)質(zhi)(zhi)的(de)分(fen)離分(fen)析(xi)，對(dui)沸(fei)點(dian)高、揮發性低(di)(di)、熱(re)穩定性差、極(ji)性強甚至極(ji)易揮發的(de)物(wu)質(zhi)(zhi)往往不(bu)能直接(jie)進樣分(fen)析(xi)。生物(wu)樣本中(zhong)含(han)有大量的(de)羥基(ji)、胺基(ji)、羧基(ji)、巰基(ji)等官能團的(de)物(wu)質(zhi)(zhi)信(xin)息，因此采用適當(dang)的(de)衍生化處理方法(fa)對(dui)于樣品(pin)的(de)分(fen)離分(fen)析(xi)往往起著(zhu)十分(fen)重要的(de)作用。樣品(pin)的(de)衍生化方法(fa)的(de)好(hao)處有：
1、將(jiang)一些(xie)不(bu)適(shi)合氣相色譜(pu)分析(xi)的物質進行適(shi)當的化(hua)(hua)學處理轉化(hua)(hua)成相應的揮發性(xing)衍生物，可以擴大氣相色譜(pu)的物質檢測范圍；
2、改變(bian)同分異構化合物的(de)色譜(pu)性(xing)能，提高(gao)和改善樣品的(de)峰形(xing)和分離度，克服(fu)載(zai)體、柱壁對高(gao)極性(xing)、低揮發樣品的(de)吸附。甚至通過特殊的(de)衍生方(fang)法，分離手性(xing)化合物；
3、改(gai)善待(dai)測(ce)物質(zhi)的(de)熱(re)穩定性，以提高檢測(ce)的(de)靈敏度；
4、改(gai)善待測物質的質譜(pu)行為，有利于鑒定化合物的結構(gou)。
一般GC-MS多用于(yu)研究初生(sheng)代謝(xie)物(wu)。固(gu)相微萃(cui)取(qu)GC-MS指的(de)是對于(yu)樣本(ben)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)揮(hui)發性(xing)物(wu)質(zhi)(zhi)進(jin)(jin)行(xing)萃(cui)取(qu)后(hou)(hou)的(de)檢(jian)(jian)測(ce)，重點(dian)在(zai)于(yu)檢(jian)(jian)測(ce)揮(hui)發性(xing)物(wu)質(zhi)(zhi)。主要過程是對頂(ding)空瓶(ping)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)氣(qi)體(ti)(ti)進(jin)(jin)行(xing)抽提的(de)時候(hou)采用涂有(you)固(gu)定相的(de)熔融(rong)石英(ying)纖(xian)維來進(jin)(jin)行(xing)吸附(fu)、富(fu)集，然后(hou)(hou)再(zai)解吸，最后(hou)(hou)打入氣(qi)相色譜(pu)質(zhi)(zhi)譜(pu)儀器中(zhong)(zhong)(zhong)進(jin)(jin)行(xing)分離分析；從而(er)進(jin)(jin)行(xing)一些揮(hui)發性(xing)或(huo)者氣(qi)味物(wu)質(zhi)(zhi)的(de)檢(jian)(jian)測(ce)的(de)原理。固(gu)相微萃(cui)取(qu)技術主要用于(yu)氣(qi)體(ti)(ti)，液體(ti)(ti)或(huo)者固(gu)體(ti)(ti)樣本(ben)中(zhong)(zhong)(zhong)揮(hui)發性(xing)組分或(huo)者半揮(hui)發性(xing)組分，氣(qi)味物(wu)質(zhi)(zhi)，香味物(wu)質(zhi)(zhi)的(de)檢(jian)(jian)測(ce)。
Q7組(zu)織和細胞樣本在(zai)收集時注意事項的(de)不同？
因(yin)為非(fei)靶(ba)向代謝組(zu)(zu)測到的(de)代謝物都(dou)是(shi)(shi)相(xiang)對(dui)含量，因(yin)此對(dui)于檢(jian)測的(de)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)起始量會要求每個樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)是(shi)(shi)基本(ben)(ben)(ben)一致的(de)。檢(jian)測公(gong)司(si)在(zai)接收到項(xiang)目樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)時，對(dui)于組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)，會對(dui)每個樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)進行稱量，取等(deng)重(zhong)量的(de)適量樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)進行后續的(de)前處理；而細(xi)胞(bao)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)，因(yin)為細(xi)胞(bao)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)是(shi)(shi)離心棄上(shang)清(qing)后收集細(xi)胞(bao)沉淀(dian)后寄送檢(jian)測公(gong)司(si)，公(gong)司(si)實驗室收到的(de)細(xi)胞(bao)沉淀(dian)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)，量較少，難以(yi)像組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)那樣(yang)(yang)進行稱重(zhong)，因(yin)此需要客戶在(zai)送樣(yang)(yang)前端就收集等(deng)數(shu)量的(de)細(xi)胞(bao)，并注明每個樣(yang)(yang)本(ben)(ben)(ben)的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)目，然后進行寄送。
Q8、做代謝組(zu)研究每(mei)組(zu)生物學重復數(shu)一(yi)定要相同嗎？
每組樣本的生(sheng)(sheng)物學(xue)重(zhong)復(fu)(fu)數(shu)目不(bu)一(yi)定要(yao)相(xiang)同，但最好(hao)不(bu)要(yao)相(xiang)差太多，差別不(bu)要(yao)超過三分(fen)之二即可。在一(yi)定程度上，生(sheng)(sheng)物學(xue)重(zhong)復(fu)(fu)數(shu)足夠(gou)比(bi)生(sheng)(sheng)物學(xue)重(zhong)復(fu)(fu)一(yi)樣更重(zhong)要(yao)。
Q9、代(dai)謝(xie)組(zu)數據分析完成后(hou)，按照VIP>1，P<0.05篩選不到差異代(dai)謝(xie)物(wu)怎么辦？
如(ru)果(guo)(guo)利用(yong)常用(yong)的篩(shai)選標(biao)準（VIP＞1和(he)(he)P＜0.05）沒有找到差(cha)(cha)異代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)，首先可以(yi)將(jiang)篩(shai)選閾值放寬(kuan)，如(ru)VIP＞1和(he)(he)P＜0. 1。如(ru)果(guo)(guo)還是沒有篩(shai)選出差(cha)(cha)異代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)，那么可以(yi)對檢測到的物(wu)質(zhi)進行(xing)單維統計學分析，如(ru)FC>1.5和(he)(he)P＜0.05，通(tong)過(guo)每(mei)單個代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)組間樣本的表達值比較分析差(cha)(cha)異代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)，并用(yong)火山圖展現。
Q10、檢測到的(de)代謝物中存在(zai)部分物質沒有KEGG數據庫的(de)ID號是怎么回事(shi)？
很(hen)多代謝(xie)物(wu)在(zai)KEGG 中沒有(you)對(dui)應(ying)的(de)(de)ID號，屬于正常，KEGG并沒有(you)把(ba)所有(you)的(de)(de)小分子代謝(xie)物(wu)都囊括進去，因(yin)此(ci)后續的(de)(de)差(cha)異代謝(xie)物(wu)通路富集分析主要是針對(dui)差(cha)異代謝(xie)物(wu)中有(you)對(dui)應(ying)的(de)(de)KEGG ID的(de)(de)物(wu)質進行的(de)(de)。
以上就是我(wo)們代(dai)謝組10問(wen)10答（三）的(de)全部內容，代(dai)謝組10問(wen)10答為許(xu)多老(lao)師同學研究代(dai)謝組打好(hao)了基礎，針(zhen)對代(dai)謝組檢測(ce)完(wan)成后如何看(kan)懂(dong)分析報(bao)告(gao)，小派也(ye)是在之前(qian)就整(zheng)理好(hao)了“圖說代(dai)謝組”報(bao)告(gao)解讀(du)，感興趣的(de)老(lao)師請戳(chuo)“”，圖文并茂，帶領大家攻克代謝組報告看不懂的問題。
