微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)、微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)(wu)群、宏基因組(zu)(zu)、代謝組(zu)(zu)……面對一長串令人(ren)眼花繚亂的(de)概念術語、研究技術、分析方法，您(nin)是(shi)不是(shi)也會(hui)感到(dao)困(kun)惑，不知從何入(ru)手呢(ni)？本期的(de)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)問答(da)集(ji)錦(jin)，就將為您(nin)答(da)疑解(jie)惑，避免混淆(xiao)和誤解(jie)，助您(nin)快速入(ru)門(men)微(wei)(wei)生(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)！

微生(sheng)(sheng)物組(zu)（Microbiome），指生(sheng)(sheng)態(tai)群(qun)落中的全體微生(sheng)(sheng)物（細菌、古細菌、低等(deng)或高等(deng)真(zhen)核生(sheng)(sheng)物和(he)病毒等(deng)各種生(sheng)(sheng)命(ming)體形式）的基(ji)因組(zu)（基(ji)因集合(he)），及其(qi)在所(suo)處生(sheng)(sheng)境內所(suo)產生(sheng)(sheng)的全部物質信息。這個定義是基(ji)于Biome（生(sheng)(sheng)物群(qun)落）而形成的，囊括了生(sheng)(sheng)態(tai)環境中的所(suo)有(you)生(sheng)(sheng)物和(he)非生(sheng)(sheng)物因素(su)。

與(yu)Microbiome相對的(de)是(shi)(shi)，Microbiota常用來(lai)指(zhi)代“微(wei)(wei)生物群”，指(zhi)的(de)是(shi)(shi)特(te)定環(huan)境中存在(zai)的(de)微(wei)(wei)生物群體的(de)集合。早(zao)期(qi)有研究使用Microflora來(lai)表述(shu)“微(wei)(wei)生物群”的(de)概(gai)念，但這一詞匯已經不適用于(yu)微(wei)(wei)生物組研究領域，被時代淘汰了。

目前普遍采用二(er)代(dai)Illumina和(he)三(san)代(dai)PacBio測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)技術開(kai)展微生物(wu)組研究。其中，二(er)代(dai)Illumina測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)技術根(gen)據(ju)通(tong)量(liang)、讀(du)(du)長(chang)等技術指標(biao)，有(you)MiSeq、NovaSeq等測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)系(xi)統，采用的(de)(de)(de)是雙末端（Paired-end，PE）測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)，即在(zai)待(dai)測(ce)(ce)(ce)(ce)DNA片段的(de)(de)(de)正反兩(liang)條鏈(lian)上(shang)，各自(zi)從5’端開(kai)始(shi)，測(ce)(ce)(ce)(ce)定相(xiang)同堿基(ji)數(shu)的(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)，目前常見的(de)(de)(de)雙末端測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)模式有(you)PE150、PE250和(he)PE300（也可表示(shi)成(cheng)2×150、2×250和(he)2×300，150/250/300是指雙末端各自(zi)測(ce)(ce)(ce)(ce)定的(de)(de)(de)堿基(ji)數(shu)）；而三(san)代(dai)PacBio測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)則(ze)通(tong)過(guo)單分(fen)子實(shi)時測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)技術（Single molecule real-time sequencing，SMRT），對(dui)DNA序(xu)(xu)列(lie)(lie)實(shi)現單分(fen)子級(ji)別的(de)(de)(de)超長(chang)讀(du)(du)長(chang)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)，并通(tong)過(guo)環形一致(zhi)(zhi)性(xing)(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)模式（Circular-consensus sequence，CCS），極(ji)大地提(ti)高單堿基(ji)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)(de)準(zhun)確率(lv)，因而具(ju)有(you)無需(xu)PCR擴增富集、超長(chang)讀(du)(du)長(chang)、堿基(ji)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)無偏好(hao)性(xing)(xing)和(he)系(xi)統性(xing)(xing)偏差、一致(zhi)(zhi)性(xing)(xing)準(zhun)確率(lv)高、原位(wei)實(shi)時直(zhi)接(jie)檢測(ce)(ce)(ce)(ce)DNA修(xiu)飾等優勢。

目前，二代Illumina測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)技術(shu)可用(yong)于多樣性組成(cheng)譜測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)（以PE250/PE300測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)模式為(wei)(wei)主）和宏基因(yin)組/宏轉錄(lu)組測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)（以PE150測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)模式為(wei)(wei)主），而三代PacBio測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)技術(shu)主要應用(yong)于多樣性組成(cheng)譜測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)（通量不及二代Illumina測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)，但能(neng)測(ce)(ce)定目標基因(yin)的(de)全長信息，因(yin)而對于優勢(shi)物種的(de)注釋而言更(geng)為(wei)(wei)精(jing)準）。

16S rRNA基(ji)(ji)(ji)因(yin)指原核(he)微生(sheng)物(wu)（細菌(jun)和(he)古菌(jun)）染色體上編碼核(he)糖體（Ribosome）RNA的(de)(de)(de)16S（S是沉降系數(shu)）小亞(ya)基(ji)(ji)(ji)（Subunit）的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)序(xu)(xu)(xu)列(lie)。該基(ji)(ji)(ji)因(yin)存在于所有(you)原核(he)微生(sheng)物(wu)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)組中(zhong)，相當(dang)于一(yi)個“分子時鐘”，序(xu)(xu)(xu)列(lie)會隨著物(wu)種的(de)(de)(de)多(duo)樣(yang)化而(er)發生(sheng)進化。它既(ji)含有(you)高(gao)度保(bao)(bao)守的(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)區(qu)域(yu)，又(you)有(you)中(zhong)度保(bao)(bao)守和(he)高(gao)度可變(bian)的(de)(de)(de)序(xu)(xu)(xu)列(lie)區(qu)域(yu)。利用保(bao)(bao)守區(qu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)設計引(yin)物(wu)，從而(er)能夠將16S rRNA基(ji)(ji)(ji)因(yin)片段(duan)進行PCR擴增并測(ce)序(xu)(xu)(xu)，這(zhe)樣(yang)就能根(gen)據(ju)可變(bian)區(qu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)(de)差異，對不同種屬的(de)(de)(de)微生(sheng)物(wu)進行物(wu)種鑒定和(he)分類。

細(xi)菌/古(gu)菌16S rRNA基因常用(yong)測序(xu)引物及(ji)其對應區域

三代(dai)PacBio平(ping)臺(tai)和二代(dai)Illumina平(ping)臺(tai)的測序模式示意圖

ITS序列全(quan)稱(cheng)為Internal transcribed spacer，即內轉錄間(jian)隔區序列，是真(zhen)核(he)(he)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)核(he)(he)糖體RNA（rRNA）基因(yin)非轉錄區的(de)(de)一部分，常用于(yu)(yu)真(zhen)菌(jun)類(lei)群(qun)的(de)(de)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)鑒定(ding)(ding)和群(qun)落組成分析。用于(yu)(yu)真(zhen)菌(jun)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)鑒定(ding)(ding)的(de)(de)ITS包(bao)括ITS1和ITS2兩個區域。其中，ITS1位于(yu)(yu)真(zhen)核(he)(he)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)18S rRNA基因(yin)和5.8S rRNA基因(yin)兩個亞基之(zhi)間(jian)，ITS2則位于(yu)(yu)真(zhen)核(he)(he)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)5.8S rRNA基因(yin)和28S rRNA基因(yin)兩個亞基之(zhi)間(jian)。

真菌ITS及(ji)真核(he)生物18S rRNA基因(yin)常用測序引物及(ji)其對(dui)應區域

（//unite.ut.ee/primers.php）

宏基(ji)(ji)因組(zu)(zu)（Metagenome）是(shi)指微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群(qun)(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)，全體成員的基(ji)(ji)因組(zu)(zu)和(he)遺傳信(xin)(xin)息(xi)。而(er)宏基(ji)(ji)因組(zu)(zu)學（Metagenomics），就是(shi)描述宏基(ji)(ji)因組(zu)(zu)特(te)征的方(fang)法(fa)手段(duan)，從(cong)中(zhong)(zhong)我們(men)可(ke)以獲得與微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群(qun)(qun)落(luo)潛在功(gong)(gong)能(neng)相(xiang)關的信(xin)(xin)息(xi)。通常，我們(men)對(dui)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)DNA片段(duan)化后(hou)進(jin)行鳥槍法(fa)測(ce)序(xu)，收集(ji)所得序(xu)列(lie)數據并進(jin)行序(xu)列(lie)組(zu)(zu)裝和(he)基(ji)(ji)因注釋，獲得群(qun)(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)各種微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)（包括(kuo)但不限(xian)于：細(xi)菌(jun)、真菌(jun)、病毒等）的基(ji)(ji)因組(zu)(zu)序(xu)列(lie)，從(cong)而(er)解析該生(sheng)(sheng)態(tai)系統下所有微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的物(wu)(wu)種分布特(te)征和(he)功(gong)(gong)能(neng)特(te)性信(xin)(xin)息(xi)。因此，宏基(ji)(ji)因組(zu)(zu)學研究(jiu)能(neng)全面精(jing)細(xi)地展(zhan)示微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群(qun)(qun)落(luo)整體性的功(gong)(gong)能(neng)代謝譜(pu)和(he)物(wu)(wu)種精(jing)細(xi)組(zu)(zu)成譜(pu)，從(cong)原理上闡明微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)群(qun)(qun)落(luo)在生(sheng)(sheng)態(tai)系統中(zhong)(zhong)發揮作用(yong)的根本(ben)機制。

宏轉錄(lu)組(zu)學(xue)(xue)（Metatranscriptomics），的(de)(de)(de)(de)(de)研究對(dui)象是微生(sheng)(sheng)物(wu)組(zu)mRNA，通過對(dui)特定時(shi)間(jian)(jian)、空間(jian)(jian)和條件狀(zhuang)態下(xia)(xia)，采(cai)集的(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)本中所有(you)微生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)(qun)(qun)落(luo)的(de)(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)本進行大規模高通量測(ce)序，可(ke)以直接獲得(de)樣(yang)本中可(ke)培養和不可(ke)培養的(de)(de)(de)(de)(de)各種(zhong)微生(sheng)(sheng)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)組(zu)及其(qi)表(biao)(biao)達量信(xin)息，從(cong)而能(neng)(neng)精確定量整個菌群(qun)(qun)(qun)中具有(you)活性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)物(wu)種(zhong)精細組(zu)成及其(qi)對(dui)應功能(neng)(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達水平，進而鎖定菌群(qun)(qun)(qun)中的(de)(de)(de)(de)(de)關鍵(jian)生(sheng)(sheng)物(wu)標(biao)記物(wu)、闡(chan)明其(qi)生(sheng)(sheng)物(wu)學(xue)(xue)意義。因此，宏轉錄(lu)組(zu)研究可(ke)以檢測(ce)微生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)(qun)(qun)落(luo)中活性(xing)物(wu)種(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)分布特征及其(qi)表(biao)(biao)達轉錄(lu)的(de)(de)(de)(de)(de)功能(neng)(neng)特性(xing)信(xin)息，同時(shi)可(ke)以比較不同時(shi)間(jian)(jian)、空間(jian)(jian)和條件狀(zhuang)態下(xia)(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)差(cha)異表(biao)(biao)達基因和差(cha)異功能(neng)(neng)途(tu)徑(jing)，從(cong)而揭示微生(sheng)(sheng)物(wu)群(qun)(qun)(qun)落(luo)在不同環境(jing)壓力下(xia)(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)調節(jie)適應機制，探(tan)索“微生(sheng)(sheng)物(wu)組(zu)——環境(jing)/宿(su)主(zhu)”之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)互作機理。

與宏基因(yin)(yin)組(zu)學相比，宏轉錄組(zu)學是在(zai)(zai)RNA水平研究微生(sheng)物(wu)組(zu)的表達譜(pu)信息，因(yin)(yin)而能(neng)提供微生(sheng)物(wu)組(zu)在(zai)(zai)環境(jing)響應(ying)以及表達調控層面的更為真實的數據結果，能(neng)有效避免(mian)群落中死亡或(huo)休眠的微生(sheng)物(wu)的影響，還能(neng)避免(mian)微生(sheng)物(wu)基因(yin)(yin)組(zu)上(shang)未真正發揮(hui)作用的基因(yin)(yin)的干擾。

生(sheng)物學重(zhong)復的(de)(de)總(zong)體(ti)設計原則就是：多多益善。一(yi)般而言，微生(sheng)物群(qun)落(luo)樣(yang)本(ben)總(zong)是存(cun)在(zai)一(yi)定的(de)(de)隨機性(xing)和不均一(yi)性(xing)，而設置(zhi)生(sheng)物學重(zhong)復將有助于(yu)評估樣(yang)本(ben)間(jian)差(cha)異(yi)程度，同時(shi)增強結(jie)(jie)果(guo)的(de)(de)可靠性(xing)。測序的(de)(de)樣(yang)本(ben)數越(yue)多，越(yue)能夠降低組內(nei)樣(yang)本(ben)差(cha)異(yi)而引(yin)入(ru)的(de)(de)影響(xiang)。此外，足夠數量的(de)(de)生(sheng)物學重(zhong)復，還(huan)有助于(yu)檢測離群(qun)樣(yang)本(ben)，因為異(yi)常(chang)樣(yang)本(ben)的(de)(de)存(cun)在(zai)，會嚴重(zhong)影響(xiang)檢測結(jie)(jie)果(guo)的(de)(de)準確性(xing)。在(zai)生(sheng)物學重(zhong)復數量足夠的(de)(de)情況下，通(tong)過分析(xi)菌群(qun)組成、Alpha和Beta多樣(yang)性(xing)指數，可以發(fa)現(xian)異(yi)常(chang)樣(yang)本(ben)，將其剔除(chu)。

如果樣(yang)(yang)本(ben)的(de)類型(xing)是(shi)動植物(wu)相關樣(yang)(yang)本(ben)，如腸道內容物(wu)或糞便樣(yang)(yang)本(ben)、組織樣(yang)(yang)本(ben)等，個(ge)體間差異較大，建(jian)議(yi)至少10~20個(ge)生物(wu)學重(zhong)復；如果樣(yang)(yang)本(ben)的(de)類型(xing)是(shi)環(huan)境樣(yang)(yang)本(ben)，如土壤、水(shui)體、空氣(qi)等，建(jian)議(yi)至少6~8個(ge)生物(wu)學重(zhong)復；提高生物(wu)學重(zhong)復的(de)數量可(ke)以大大減(jian)小生物(wu)個(ge)體間存在(zai)的(de)誤差。

對于(yu)微生物組(zu)研究而(er)(er)言，有無重復(fu)，判斷(duan)差異物種或(huo)差異基因(yin)的(de)(de)統(tong)計檢驗(yan)(yan)方法是不同(tong)的(de)(de)。一(yi)般(ban)而(er)(er)言，在有生物學(xue)重復(fu)的(de)(de)情況下，差異的(de)(de)評估(gu)是根據重復(fu)樣本來評估(gu)，統(tong)計檢驗(yan)(yan)的(de)(de)方法更(geng)為多(duo)樣，分(fen)析(xi)(xi)手段更(geng)為豐富（如常見的(de)(de)Adonis分(fen)析(xi)(xi)、LEfSe分(fen)析(xi)(xi)、隨機森(sen)林分(fen)析(xi)(xi)等(deng)）；而(er)(er)在無生物學(xue)重復(fu)的(de)(de)情況下，差異只(zhi)能通(tong)過(guo)單獨樣本的(de)(de)菌群(qun)組(zu)成(cheng)豐度(du)或(huo)基因(yin)豐度(du)來估(gu)計，容易產生偏差，分(fen)析(xi)(xi)方法的(de)(de)選擇(ze)很少(shao)。

一般(ban)而言，微生物組研究(jiu)(jiu)可以分為(wei)橫(heng)向和縱向兩種主要的(de)(de)(de)(de)研究(jiu)(jiu)思路。橫(heng)向研究(jiu)(jiu)主要是(shi)指多個不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)平行(xing)處(chu)理(li)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)相互比較，而縱向研究(jiu)(jiu)一般(ban)是(shi)指多個不(bu)同(tong)時(shi)期/階段之間(jian)的(de)(de)(de)(de)動態變化。在(zai)設計實驗時(shi)，首先需要確定(ding)采取的(de)(de)(de)(de)研究(jiu)(jiu)思路，當然也可以橫(heng)向、縱向研究(jiu)(jiu)相結合(he)。

此(ci)外，微(wei)生(sheng)物組學研究實驗設計還應遵循以下原則(ze)：

微(wei)生物組(zu)學研究流程(cheng)，主(zhu)要包括研究設計、實(shi)驗檢(jian)測、數據分析(xi)和實(shi)驗驗證四(si)大環節。

對于(yu)(yu)實驗(yan)測(ce)(ce)序(xu)環節而言(yan)，又可(ke)細(xi)分為：微生物(wu)組(zu)核酸提(ti)取（DNA或RNA）→測(ce)(ce)序(xu)文庫(ku)(ku)制備（對于(yu)(yu)多樣性(xing)組(zu)成譜測(ce)(ce)序(xu)，需(xu)要在PCR擴增后方可(ke)構建文庫(ku)(ku)）→上(shang)機測(ce)(ce)序(xu)等步驟；

數據(ju)分析(xi)環節(jie)可細分為：數據(ju)質控和預(yu)處理(li)→注釋(shi)(shi)分析(xi)（根據(ju)檢測方法的(de)不同，可能涉(she)及物(wu)種注釋(shi)(shi)、功能注釋(shi)(shi)和代謝注釋(shi)(shi)等）→生(sheng)態學分析(xi)（如Alpha和Beta多(duo)樣(yang)性(xing)分析(xi)等）→多(duo)變量統計(ji)分析(xi)→標(biao)志(zhi)物(wu)識(shi)別等步(bu)驟(zou)；

基于上(shang)述(shu)研究設(she)計(ji)和數據(ju)分析結果，可(ke)以通過體外實驗(yan)、無(wu)菌(jun)動物(wu)模型等(deng)體內實驗(yan)、熒(ying)光定(ding)量qPCR等(deng)策略(lve)，對候選得到的(de)生物(wu)標志物(wu)進行進一(yi)步的(de)實驗(yan)驗(yan)證(zheng)，以明(ming)確特定(ding)微(wei)生物(wu)和宿主、環(huan)境之間的(de)互作(zuo)關系和因果鏈。

（//www.nature.com/articles/d42473-020-00214-9）

Microbiome-wide association study，即全微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)關(guan)聯(lian)分(fen)析(xi)(xi)。對于(yu)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)研(yan)究，除了通過(guo)測序和差異(yi)統計分(fen)析(xi)(xi)來(lai)篩選各組(zu)(zu)樣本中的(de)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)種(zhong)或(huo)基(ji)因(yin)（Biomarker）的(de)信息外，我們(men)還需要將其它各種(zhong)檢測手段獲(huo)(huo)得(de)的(de)數(shu)據(ju)，比如代謝組(zu)(zu)、蛋白組(zu)(zu)、或(huo)檢測獲(huo)(huo)得(de)的(de)理化指標(biao)、臨床(chuang)指標(biao)等各類數(shu)據(ju)，與(yu)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)的(de)海量數(shu)據(ju)進行關(guan)聯(lian)分(fen)析(xi)(xi)，以期找(zhao)出與(yu)各類指標(biao)變化相關(guan)聯(lian)的(de)具體微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)物(wu)(wu)種(zhong)及其基(ji)因(yin)。這種(zhong)研(yan)究思路(lu)，統稱為全微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)組(zu)(zu)關(guan)聯(lian)分(fen)析(xi)(xi)。

（Zhao, 2013, Nat Rev Microbiol 11, 639-647）