2020-10-15
單細胞轉錄組測序技術即在單個細胞水平上，對轉錄組進行高通量測序分析，其讓研究人員能夠獲取之前經常會被大量細胞的RNA-seq方法所掩蓋的關鍵數據，如罕見或新的細胞類型，從而在單細胞水平上探索基因表達多樣性。
圖(tu)1.單細胞測(ce)序(xu)揭示了被傳統的(de)(de)大量細胞RNA-seq方法所掩蓋的(de)(de)細胞異質性。
10x Genomics 作(zuo)為單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)轉錄組測(ce)(ce)(ce)序技術主流(liu)平(ping)臺之一，能實(shi)現大(da)規模的(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)轉錄組測(ce)(ce)(ce)序，具有細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)通量高(gao)、細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)捕獲率高(gao)、項目周期短等優點，并(bing)廣泛應用于細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)異(yi)質性(xing)、免疫細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)群體檢測(ce)(ce)(ce)及構(gou)建細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)圖譜(pu)等研究。
接下來為大家介紹下10X Genomics單(dan)細胞測序的技(ji)術原(yuan)理及樣本制備時所需滿(man)足的要(yao)求(qiu)。
技術原理
Gel beads及其核酸(suan)序(xu)列構(gou)成
Gel beads，即凝膠微(wei)(wei)珠(zhu)。每個凝膠微(wei)(wei)珠(zhu)上有40-80萬(wan)特(te)定的(de)核酸引(yin)物序(xu)(xu)列，該(gai)序(xu)(xu)列由以下(xia)幾(ji)部分構成：Read 1 測(ce)序(xu)(xu)引(yin)物、10X Barcode序(xu)(xu)列（16 nt，一(yi)個Gel bead對應(ying)一(yi)種10X Barcode，共有~350W種10X Barcode，用于區分細胞）、UMI（unique molecular identifier，12 nt，隨(sui)機序(xu)(xu)列，區分同一(yi)細胞的(de)不同轉(zhuan)錄(lu)本）、poly dT反轉(zhuan)錄(lu)引(yin)物（30nt）。
圖2.Gel beads構成
微流控技術
如圖，在(zai)10X Genomics Chromium的(de)8通道的(de)微(wei)(wei)流(liu)體(ti)“雙十字”交(jiao)叉系統中，Gel Beads與(yu)細(xi)胞/酶的(de)混(hun)合(he)物在(zai)第一個(ge)十字交(jiao)叉口(kou)結合(he)，然后在(zai)第二個(ge)十字交(jiao)叉口(kou)，油將Gel Beads與(yu)細(xi)胞/酶的(de)混(hun)合(he)物包(bao)裹起來，形成(cheng)油包(bao)水結構，即(ji)GEM（Gel Beads-in-emulsion）。
圖3.微流控技術
GEMs形成(cheng)后，細胞裂解，Gel Beads自(zi)動溶解釋放大量barcode序(xu)列，這些序(xu)列與mRNA相(xiang)結合，隨(sui)后mRNA逆(ni)轉錄(lu)產(chan)生(sheng)cDNA；將得到的(de)(de)(de)cDNA進(jin)行純化、富集，用于(yu)后續構建標(biao)(biao)準測序(xu)文庫。其中，來自(zi)同一細胞的(de)(de)(de)cDNA序(xu)列均帶(dai)有對應凝膠微(wei)珠所(suo)特有的(de)(de)(de)相(xiang)同的(de)(de)(de)Barcode標(biao)(biao)簽，并(bing)且每(mei)個cDNA分子各(ge)自(zi)還會帶(dai)有特定的(de)(de)(de)UMI標(biao)(biao)簽。
綜上(shang)，微流控(kong)技(ji)術實現了單(dan)個細胞(bao)的(de)分離；Barcoding技(ji)術則區分不同(tong)的(de)細胞(bao)以及同(tong)一細胞(bao)中同(tong)一基(ji)因的(de)不同(tong)轉錄本。
前期單細胞懸液樣(yang)本制備(bei)所需滿(man)足要求
1.細胞重懸Buffer
在處理懸浮細(xi)(xi)(xi)胞系、解(jie)離組(zu)織(zhi)或(huo)大量細(xi)(xi)(xi)胞時，建議對細(xi)(xi)(xi)胞進行(xing)(xing)徹底(di)的(de)清洗，避(bi)免影(ying)響后續的(de)細(xi)(xi)(xi)胞回收效(xiao)率(lv)。推(tui)薦使用(yong)1X PBS（calcium and magnesium free）with 0.04% BSA (400 μg/ml)清洗、重懸細(xi)(xi)(xi)胞。此(ci)外(wai)，對于敏(min)感的(de)細(xi)(xi)(xi)胞類型，也可選(xuan)擇(ze)替代的(de)溶液或(huo)者(zhe)培(pei)養基(ji)進行(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)胞清洗及重懸。
Alternative Buffers ：
? Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)
? Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)
Alternative Media ：
? Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) + 10% FBS
? Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS
? Iscove’s Modified Eagle Medium (IMEM) + 10% FBS
? Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% FBS
? Ham’s F12 + 10% FBS
? 1:1 DMEM/F12 +10% FBS
? M199
2.細(xi)胞(bao)懸液過(guo)濾
大的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)團塊、雜質(zhi)或碎(sui)片會增加微(wei)流體芯(xin)片的(de)(de)(de)(de)堵塞風險，并(bing)且干擾準(zhun)確(que)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計數，從而影(ying)響細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)回收。為(wei)了避免這(zhe)一問(wen)題，建議使(shi)用孔徑為(wei)30-40μm的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)篩網對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液進行過濾；此外，如果(guo)懸(xuan)液中(zhong)存在大量紅(hong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，會干擾后續(xu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)準(zhun)確(que)計數，建議使(shi)用紅(hong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)裂解液去除紅(hong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，確(que)保(bao)制備的(de)(de)(de)(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液中(zhong)無(wu)明顯雜質(zhi)，無(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)碎(sui)片，無(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)粘連，無(wu)紅(hong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)干擾。
3.細胞活(huo)性及濃(nong)度
在細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)清洗和(he)過濾之后，需測定(ding)(ding)其細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性及(ji)濃度(du)，以判斷細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)狀態并(bing)確(que)定(ding)(ding)上樣(yang)時的準確(que)體積。推薦(jian)使(shi)用臺(tai)盼藍染色法(fa)或者熒光染色法(fa)來檢測細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性；同時可(ke)采用細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計數(shu)設備（如(ru)血球計數(shu)器或自動細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計數(shu)儀）進行定(ding)(ding)量。
當細胞活性＞80%且濃度介于700-1,200 cells/μl（體積不少于100μl）時，捕獲細胞數及基因檢出率更容易達到目標值。細胞懸液的濃度一旦超出這個最佳范圍，將會導致細胞計數不可靠，建議相應地調整細胞懸液的濃度；而高比例的死細胞可能會影響目標細胞的捕獲，并且會釋放核酸造成背景噪音，因此對于死細胞比例較高（>20%）的樣本，建議使用去死細胞試劑盒/磁珠分選/流式分選的方式降低單細胞懸液中的死細胞比例。
圖4.自(zi)動細胞計(ji)數儀檢測細胞活性
4.樣(yang)本(ben)制備后(hou)的保存
為了最大限(xian)度地減少轉錄組的變(bian)化，在對細胞(bao)進行清洗(xi)、過(guo)濾和檢測后(hou)，單細胞(bao)懸液應(ying)當保存(cun)于(yu)(yu)冰上(shang)，直至用于(yu)(yu)后(hou)續(xu)的上(shang)機和文庫制(zhi)備步驟。在理想狀況(kuang)下，一旦制(zhi)備好樣本，應(ying)當在30分鐘內將(jiang)其用于(yu)(yu)下游(you)步驟。
5.特殊細胞類(lei)型
由于10X芯片(pian)孔徑的限制(zhi)，要(yao)求細(xi)胞(bao)直(zhi)徑＜40 μm；植(zhi)物細(xi)胞(bao)需制(zhi)成原生質體。
