2020-10-21
作為空間轉錄組的熱粉，小派已經帶大家進行過入門，文章解讀，分析流程解析的學習，今天咱們就來點更實際的，想要開展空間轉錄組，肯定會遇到各種各樣的問題，下面就以Q&A的形式，給大家捋捋咱們的空轉小疑惑：
Q1想要做(zuo)空間轉(zhuan)錄(lu)組，那么什(shen)么樣(yang)本都可(ke)以(yi)去做(zuo)空轉(zhuan)嗎？
A1對于(yu)哪些(xie)樣本(ben)可以(yi)做空(kong)間轉錄組，可以(yi)先參(can)考(kao)官(guan)方信息，目前，10x 官(guan)方已經測試的(de)樣本(ben)類型如下：
人類：大(da)腦(nao)（小腦(nao)、大(da)腦(nao)皮(pi)層、多形性腦(nao)膠質(zhi)母細(xi)胞瘤），脊髓（正常(chang)），心(xin)臟(zang)（正常(chang)和心(xin)肌梗塞），腎臟(zang)（正常(chang)和腎炎(yan)(yan)），大(da)腸(chang)（結直腸(chang)癌(ai)），肺（正常(chang)，乳頭狀(zhuang)腺(xian)癌(ai)）卵巢(chao)（腫瘤），乳腺(xian)（正常(chang)，浸潤性導管癌(ai)，浸潤性小葉癌(ai)），脾臟(zang)（炎(yan)(yan)癥），淋巴（正常(chang)，炎(yan)(yan)癥）等；
小鼠：大(da)腦，心臟(zang)，小腸和大(da)腸，胃，肝臟(zang)，腎，四頭肌(ji)，肺，睪丸，甲狀腺，胸(xiong)腺，眼睛，舌(she)頭，嗅球，脾臟(zang)等；
大(da)鼠：腦(nao)，腎，心(xin)臟，嗅球等；
斑馬(ma)魚：幼體(ti)
最(zui)新的測試信(xin)息(xi)可以直接參考官網(wang)：//support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/tissue-optimization/doc/specificatio ns-visium-spatial-gene-expression-optimized-tissues；
如(ru)果(guo)咱們的樣本不(bu)在測試(shi)行列內，則(ze)需(xu)要進(jin)行評估。
Q2做空轉的組織確(que)定好了，組織準(zhun)備保存方面有什么要注意的呢？
A2獲取新(xin)鮮組織后，要(yao)對組織進行(xing)一定的處理(li)，處理(li)和保(bao)存方法如下：
先冷(leng)(leng)(leng)凍(dong)(dong)后包(bao)埋法(fa)：新鮮組(zu)織(zhi)樣(yang)本取(qu)下(xia)(xia)后要迅(xun)速(su)用預(yu)冷(leng)(leng)(leng)的(de)PBS溶液(ye)或(huo)生理鹽水進行沖洗，去除組(zu)織(zhi)表面殘(can)留，然(ran)后用干凈的(de)吸(xi)(xi)水紙吸(xi)(xi)干液(ye)體，用預(yu)冷(leng)(leng)(leng)的(de)鑷子(zi)將(jiang)新鮮組(zu)織(zhi)浸(jin)沒在異(yi)戊烷，組(zu)織(zhi)速(su)凍(dong)(dong) 1min 或(huo)直至組(zu)織(zhi)完全冷(leng)(leng)(leng)凍(dong)(dong)(實際冷(leng)(leng)(leng)凍(dong)(dong)時間取(qu)決于(yu)組(zu)織(zhi)形態及(ji)大小)，一旦冷(leng)(leng)(leng)凍(dong)(dong)，將(jiang)組(zu)織(zhi)轉移(yi)到一個預(yu)冷(leng)(leng)(leng)的(de) WHEATON CryoELITE 低溫冷(leng)(leng)(leng)凍(dong)(dong)瓶中，并(bing)放置(zhi)在干冰上(shang)。接下(xia)(xia)來(lai)冷(leng)(leng)(leng)凍(dong)(dong)組(zu)織(zhi)可(ke)放置(zhi)在-80℃下(xia)(xia)長期保存或(huo)立即(ji)進行下(xia)(xia)一步冷(leng)(leng)(leng)凍(dong)(dong)組(zu)織(zhi)OCT包(bao)埋。
包(bao)埋和冷凍同時(shi)進(jin)行法：某(mou)些非常柔(rou)軟的組織(zhi)（比(bi)如胚胎等(deng)），失去液體的支撐就(jiu)會(hui)改變其正常形(xing)態，對于(yu)這樣的組織(zhi)可(ke)采(cai)(cai)取冷凍和包(bao)埋同時(shi)進(jin)行的方(fang)法。沒有異戊(wu)烷的條件(jian)下，可(ke)以采(cai)(cai)取包(bao)埋和冷凍同時(shi)進(jin)行的方(fang)法。
TIPS
冷凍包(bao)埋方(fang)法(fa)(fa)不僅僅局限于(yu)上述兩(liang)種方(fang)式，其他方(fang)法(fa)(fa)可以(yi)咨詢評(ping)估，樣本(ben)質檢合格，也(ye)可用于(yu)嘗試進(jin)行空間轉(zhuan)錄組實驗（詳(xiang)細的樣本(ben)準備資料(liao)和視(shi)頻可以(yi)聯系銷售(shou)獲(huo)取）。
Q3直(zhi)接液(ye)氮凍存的(de)樣本，保存了(le)很久，可(ke)以做空間轉(zhuan)錄組嗎？
A3液氮凍存會(hui)在(zai)組織(zhi)表面(mian)產(chan)生(sheng)冰(bing)晶，冰(bing)晶會(hui)影響后(hou)期切片的組織(zhi)結(jie)構(gou)。保存時間久可(ke)能會(hui)有RNA的降解(jie)。這種情況，首先建議如果樣(yang)(yang)本可(ke)以(yi)重(zhong)新(xin)獲(huo)得，最好(hao)(hao)是(shi)用預冷(leng)的異戊烷包(bao)埋重(zhong)新(xin)準備。如果前期收集的樣(yang)(yang)本，后(hou)期無(wu)法(fa)重(zhong)新(xin)獲(huo)得，則(ze)可(ke)以(yi)將(jiang)樣(yang)(yang)本進(jin)(jin)(jin)行切片嘗試(shi)。一般先切10張(zhang)切片進(jin)(jin)(jin)行RNA質(zhi)控檢驗(yan)，如果質(zhi)檢合格，可(ke)以(yi)對切片進(jin)(jin)(jin)行HE染色(se)，染色(se)結(jie)果如果顯示(shi)老師感興趣的區域(yu)組織(zhi)結(jie)構(gou)完好(hao)(hao)，則(ze)可(ke)以(yi)進(jin)(jin)(jin)行后(hou)續(xu)實驗(yan)。如果結(jie)構(gou)破壞嚴重(zhong)，則(ze)即使RNA質(zhi)量完好(hao)(hao)，也(ye)無(wu)法(fa)進(jin)(jin)(jin)行后(hou)續(xu)實驗(yan)。
Q4空間轉錄組對于(yu)的(de)組織大小有(you)什么(me)要(yao)求(qiu)嗎？
A4空間轉錄組(zu)Visium芯(xin)片的(de)捕(bu)獲(huo)面(mian)積(ji)(ji)為6.5mmX6.5mm，所(suo)以在選擇樣(yang)本(ben)前，首先確 認好最佳的(de)取材位置及(ji)合(he)理的(de)組(zu)織大小(xiao)，可以保(bao)證Visium芯(xin)片的(de)有效利用(yong)率(lv)。因此對于樣(yang)本(ben)大小(xiao)，和捕(bu)獲(huo)區(qu)域(yu)比較(jiao)合(he)適(shi)的(de)最好，大于捕(bu)獲(huo)區(qu)域(yu)面(mian)積(ji)(ji)的(de)樣(yang)本(ben)，可以考慮(lv)放在兩個(ge)捕(bu)獲(huo)區(qu)域(yu)。小(xiao)于捕(bu)獲(huo)區(qu)域(yu)面(mian)積(ji)(ji)的(de)樣(yang)本(ben)，很難做到一個(ge)區(qu)域(yu)放多個(ge)樣(yang)本(ben)，只能試做。
Q5空間轉錄組對于樣本(ben)個數有什(shen)么限制嗎，必須是4個樣本(ben)的倍(bei)數個嗎？
A5空間轉錄組的正(zheng)式實驗(yan)，一(yi)個(ge)玻(bo)片(pian)有四個(ge)捕獲區域。一(yi)個(ge)玻(bo)片(pian)必須一(yi)起操(cao)作，所以未滿四個(ge)樣本(ben)仍然會消耗一(yi)個(ge)玻(bo)片(pian)，所以從成本(ben)上(shang)考慮，4個(ge)樣本(ben)或者4的倍(bei)數個(ge)樣本(ben)是最優的方案。正(zheng)式實驗(yan)過程如下(xia)：
Q6空間(jian)轉(zhuan)錄組(zu)的(de)前(qian)期需要進行(xing)預(yu)(yu)透(tou)(tou)化，會不會預(yu)(yu)透(tou)(tou)化的(de)時候找不到最佳條件呢？
A6對于預(yu)透化，我們已針(zhen)對很多個(ge)(ge)樣本進行了測試。樣本的(de)最佳(jia)透化時(shi)間(jian)，其實是(shi)一(yi)個(ge)(ge)比(bi)較(jiao)長的(de)時(shi)間(jian)范(fan)圍，在(zai)那(nei)個(ge)(ge)范(fan)圍內都可(ke)以(yi)達(da)到很好的(de)mRNA釋放的(de)效果。所以(yi)一(yi)般(ban)的(de)組織(zhi)經過預(yu)實驗(yan)摸索基本都可(ke)以(yi)找到最佳(jia)的(de)透化時(shi)間(jian)。
Q7那(nei)前(qian)面說(shuo)空間轉錄(lu)組(zu)最好是(shi)四個(ge)樣本(ben)(ben)一起做，這四個(ge)樣本(ben)(ben)，每個(ge)樣本(ben)(ben)都需要單獨進(jin)行預透(tou)化嗎？
A7通(tong)常情(qing)況(kuang)下，正常樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)的(de)(de)(de)最佳透化時(shi)(shi)間(jian)(jian)都是差不多的(de)(de)(de)，所以(yi)如果(guo)四個(ge)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)均是正常組織的(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)，只是處理略(lve)微(wei)不同，則可(ke)以(yi)選擇一個(ge)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)進(jin)行(xing)預透化即(ji)可(ke)；但(dan)是對于疾病狀態(tai)下的(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)，最佳透化時(shi)(shi)間(jian)(jian)會(hui)差異(yi)比較大，如果(guo)是疾病狀態(tai)的(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)，建議每個(ge)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)分別進(jin)行(xing)預透化實驗以(yi)摸索每個(ge)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)的(de)(de)(de)最佳透化時(shi)(shi)間(jian)(jian)。
Q8空間(jian)轉錄組的檢測是單(dan)細胞層面(mian)的嗎？
A8空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)的(de)(de)檢測不是單細(xi)胞(bao)層(ceng)面的(de)(de)，官(guan)方的(de)(de)Visium芯片，一個(ge)玻片上有四個(ge)捕獲區域，如(ru)下(xia)圖(tu)，每個(ge)捕獲區域面積為6.5mmX6.5mm，每個(ge)面積內有5000個(ge)spot，每個(ge)spot內的(de)(de)細(xi)胞(bao)數(shu)會(hui)根據(ju)(ju)樣本類(lei)型有所(suo)不同，一般(ban)(ban)是十幾(ji)個(ge)或幾(ji)十個(ge)細(xi)胞(bao)。所(suo)以一般(ban)(ban)空(kong)(kong)間(jian)(jian)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)文章中(zhong)空(kong)(kong)轉(zhuan)都會(hui)搭配單細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)(lu)組(zu)數(shu)據(ju)(ju)進(jin)行聯合分析。
Q9空間轉(zhuan)(zhuan)錄組測序和單細(xi)胞轉(zhuan)(zhuan)錄組測序一起進行的(de)話，每個空轉(zhuan)(zhuan)的(de)樣(yang)本都需要搭(da)配(pei)這個樣(yang)本的(de)單細(xi)胞轉(zhuan)(zhuan)錄組嗎？
A9這個(ge)(ge)按照老師的實(shi)驗(yan)設計來(lai)。如(ru)果空轉的樣(yang)本(ben)(ben)來(lai)自(zi)四個(ge)(ge)病(bing)人，那么建議每個(ge)(ge)病(bing)人做(zuo)一個(ge)(ge)單(dan)細(xi)胞。如(ru)果有幾個(ge)(ge)空轉的樣(yang)本(ben)(ben)來(lai)自(zi)一個(ge)(ge)病(bing)人的同一個(ge)(ge)組(zu)織，可以(yi)這幾個(ge)(ge)樣(yang)本(ben)(ben)配一個(ge)(ge)單(dan)細(xi)胞。
10空間轉錄組主(zhu)要可以應(ying)用于哪些領域呢？
10空(kong)間(jian)轉錄(lu)組研(yan)究分析組織的(de)空(kong)間(jian)位(wei)置(zhi)信息(xi)，有(you)助于(yu)揭示精確空(kong)間(jian)范圍內發生(sheng)的(de)信號(hao)傳導(dao)通路和(he)細胞行為(wei)，解析目標生(sheng)物學過程的(de)更深層次(ci)的(de)分子機制，多應用于(yu)醫學相關的(de)研(yan)究方(fang)向：
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