2020-10-26
2020年(nian)即將過去，2021年(nian)還會遠嗎？抓(zhua)住2020年(nian)的小尾巴(ba)，蛋(dan)白(bai)組(zu)研究做(zuo)起來~~~
小派(pai)此(ci)次(ci)整理了蛋白(bai)組(zu)10問10答——基礎版(ban)，幫助大家快速入門蛋白(bai)組(zu)，讓蛋白(bai)組(zu)給(gei)自己的科研(yan)之(zhi)路助一臂之(zhi)力。
Q1. 蛋白(bai)組的研究必要性(xing)你知道嗎？
A1. 蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)組(Proteome)的(de)(de)(de)概(gai)念最先由Marc Wilkins提(ti)出，指由細(xi)胞或組織表達的(de)(de)(de)所有(you)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(protein)集合(he)，此(ci)處(chu)劃重(zhong)點(dian)，蛋(dan)(dan)白(bai)組是檢測的(de)(de)(de)樣(yang)本內的(de)(de)(de)累積(ji)蛋(dan)(dan)白(bai)量。
基因雖然(ran)是遺(yi)傳(chuan)信息的源(yuan)頭，而蛋白確實基因功能(neng)的執(zhi)行(xing)者
蛋白(bai)本身(shen)的(de)(de)存在形式和(he)活動規律，如(ru)蛋白(bai)間的(de)(de)互作、蛋白(bai)修飾和(he)蛋白(bai)結構等問題，必須從蛋白(bai)組的(de)(de)角(jiao)度研究(jiu)才能解(jie)決
蛋白的(de)變化在臨床(chuang)上往(wang)(wang)往(wang)(wang)會(hui)作為病理研究的(de)主(zhu)要對象，同時也可(ke)作為疾(ji)病診斷的(de)標志物(wu)以(yi)及對于藥物(wu)的(de)篩選有(you)重要意義
Q2. 蛋白組研究的常用手(shou)段(duan)有哪些(xie)？
A2. 根據目的的不同，蛋白組研究的常用技術手段也有較大差異。
雙向電泳(yong)技術(shu)（理想(xiang)目的：將細胞（或組織）內所有蛋白(bai)質都分離開來）
質譜技(ji)術(shu)及一系列(lie)派(pai)生技(ji)術(shu) （測蛋白質序列(lie)）
蛋白(bai)質互(hu)相作用研究：酵母雙雜交，細菌雙雜交，免疫共沉淀技術，pull-down，FRET,BiFC等
蛋白質(zhi)定位：熒(ying)光(guang)標(biao)記技(ji)術，共聚焦熒(ying)光(guang)顯微鏡(jing)技(ji)術，免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)，免(mian)疫(yi)化學等技(ji)術。
其中，通量最高，結(jie)果轉化(hua)最快，應用范圍最廣(guang)的技(ji)(ji)術手段要數質(zhi)譜技(ji)(ji)術及(ji)一系列派(pai)生(sheng)技(ji)(ji)術，通過(guo)質(zhi)譜平臺(tai)，可以對樣(yang)本(ben)中的蛋白進行定(ding)性和(he)定(ding)量分析，明確不同生(sheng)長(chang)條件，不同生(sheng)理(li)狀態，不同樣(yang)本(ben)之間的蛋白表達差異。
Q3. 質譜技(ji)(ji)術及一系(xi)列派生(sheng)技(ji)(ji)術包含哪些？
A3. shotgun蛋白定性檢測——檢測樣本中的蛋白質類型，最為(wei)基(ji)礎，入門款；
定(ding)量蛋(dan)(dan)白(bai)組檢測——揭示(shi)樣本中蛋(dan)(dan)白(bai)質種類和表達量，進階款(kuan)；
修飾蛋白組檢測——研究樣本中某種(zhong)修飾類型蛋白質種(zhong)類和表達量，飛(fei)升款；
PRM（目標(biao)蛋(dan)白定(ding)量檢測(ce)）——對定(ding)量蛋(dan)白組結(jie)果中的目標(biao)蛋(dan)白進(jin)行驗證(zheng)，必須款。
以(yi)上(shang)是基于質(zhi)譜平臺(tai)所做的常見蛋(dan)白組研(yan)究技術。詳(xiang)情(qing)可以(yi)點擊下方鏈接，了(le)解每(mei)種技術的詳(xiang)情(qing)和應用(yong)。（點擊查看(kan)）后(hou)面我們的討論也是針對質譜(pu)平臺進行蛋白組研(yan)究開展討論
Q4. 哪些(xie)樣本類型可以基于質譜平臺進(jin)行(xing)蛋白組研(yan)究?
A4. 原則(ze)上，所有含有蛋(dan)(dan)白的(de)樣(yang)(yang)本都可以(yi)進行蛋(dan)(dan)白組質(zhi)譜研究，只(zhi)是不同樣(yang)(yang)本中的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)量(liang)可能不同，對于蛋(dan)(dan)白量(liang)比較低的(de)樣(yang)(yang)本，在做質(zhi)譜檢測(ce)之前可能會涉(she)及(ji)蛋(dan)(dan)白濃(nong)縮富集(ji)的(de)環節。
Q5. 基于質(zhi)譜(pu)平臺做蛋(dan)白組是否有物種限制(zhi)？
A5. 基(ji)于質譜平臺進行蛋(dan)白(bai)(bai)組(zu)(zu)檢測，首先就是要(yao)進行蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)鑒(jian)定，此分(fen)析(xi)依賴于該物(wu)種(zhong)的(de)(de)(de)參(can)(can)考(kao)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)中的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)數據(ju)庫，一般(ban)而(er)言，需要(yao)有參(can)(can)考(kao)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)的(de)(de)(de)物(wu)種(zhong)才能進行蛋(dan)白(bai)(bai)組(zu)(zu)研(yan)(yan)究，但是如果研(yan)(yan)究物(wu)種(zhong)暫時沒有公開可(ke)用(yong)的(de)(de)(de)參(can)(can)考(kao)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)，可(ke)以使用(yong)近源物(wu)種(zhong)的(de)(de)(de)參(can)(can)考(kao)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)或者本(ben)物(wu)種(zhong)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄組(zu)(zu)數據(ju)作為蛋(dan)白(bai)(bai)鑒(jian)定所需的(de)(de)(de)數據(ju)庫。當(dang)然，由于物(wu)種(zhong)之(zhi)間存在差(cha)異，最優(you)方(fang)法仍是使用(yong)本(ben)物(wu)種(zhong)的(de)(de)(de)參(can)(can)考(kao)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)(zu)進行蛋(dan)白(bai)(bai)鑒(jian)定分(fen)析(xi)。
Q6. 目前蛋白(bai)組文章中經常出現ITRAQ和TMT到底是(shi)什么？我(wo)應(ying)該選擇哪一個？
A6. ITRAQ（Isobaric tag for relative and absolute quantitation）和(he)(he)TMT（Tandem Mass Tags）是(shi)定量(liang)蛋白組檢測中所用(yong)(yong)到的(de)(de)(de)、不同(tong)(tong)(tong)(tong)生產商所生產的(de)(de)(de)同(tong)(tong)(tong)(tong)位素標(biao)(biao)簽(qian)，目的(de)(de)(de)是(shi)給樣(yang)本(ben)帶上標(biao)(biao)記，方便樣(yang)本(ben)可以進(jin)行混合一次上機，避(bi)免分(fen)批次上機引入的(de)(de)(de)誤(wu)差(cha)。ITRAQ和(he)(he)TMT只是(shi)同(tong)(tong)(tong)(tong)位素標(biao)(biao)簽(qian)的(de)(de)(de)數目不同(tong)(tong)(tong)(tong)，可以一次性(xing)標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)最多樣(yang)本(ben)數不同(tong)(tong)(tong)(tong)。ITRAQ和(he)(he)TMT分(fen)別是(shi)由美國AB SCIEX和(he)(he)Thermo公司(si)研(yan)發，ITRAQ是(shi)4標(biao)(biao)和(he)(he)8標(biao)(biao)的(de)(de)(de)，TMT是(shi)2、6、10、16標(biao)(biao)的(de)(de)(de)，具體應該使用(yong)(yong)哪個一個品牌(pai)都可以，不需(xu)執著于一定要(yao)使用(yong)(yong)哪一品牌(pai)。根據文章中出現ITRAQ或TMT，我們只需(xu)明確(que)該文章使用(yong)(yong)了標(biao)(biao)記定量(liang)蛋白組即可。
Q7. 對于標記定量蛋白組，在每(mei)個樣(yang)本帶上標簽后(hou)，會將所有肽段MIX混合后(hou)進行色譜分級，其目(mu)的是什么(me)？
A7. 通(tong)過色譜分(fen)(fen)級，將(jiang)所有肽段(duan)分(fen)(fen)離成多(duo)個復雜度(du)相對更低的組分(fen)(fen)，每個組分(fen)(fen)依次上機，有利于后續質譜檢測出更多(duo)的物(wu)質。
Q8. 進行質譜檢測蛋白組的樣本(ben)應(ying)該如何(he)處理(li)、運輸(shu)和保(bao)存？
A8. 細胞、組織、蛋白(bai)溶液、菌體等(deng)樣品(pin)最好采用(yong)收集后液氮速(su)凍，干(gan)冰運(yun)(yun)輸，對于SDS-PAGE條帶和(he)2D點以及酶解好的肽段(duan)樣品(pin)直接常溫運(yun)(yun)輸即可，如(ru)果天氣較熱，路途較遠，也可以進行液氮速(su)凍，干(gan)冰運(yun)(yun)輸。
Q9. 哪些樣(yang)本進(jin)行蛋白(bai)組(zu)研究需(xu)要去除高豐度(du)蛋白(bai)的去除？
A9. 一般情況下，血(xue)清、血(xue)漿(jiang)樣(yang)品中(zhong)都會存在高(gao)豐(feng)度蛋白(bai)(bai)(bai)（白(bai)(bai)(bai)蛋白(bai)(bai)(bai)等免疫蛋白(bai)(bai)(bai)），如果是(shi)此類(lei)樣(yang)本，目(mu)前人/鼠等物種的(de)血(xue)漿(jiang)/血(xue)清樣(yang)本已有成熟試劑盒去(qu)除(chu)高(gao)豐(feng)度蛋白(bai)(bai)(bai)，但某(mou)些(xie)物種或(huo)樣(yang)本中(zhong)的(de)高(gao)豐(feng)度蛋白(bai)(bai)(bai)，如雞(ji)蛋清等樣(yang)本，尚無成熟方法高(gao)豐(feng)度蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)去(qu)除(chu)。高(gao)豐(feng)度蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)存在會導致其他蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)檢測(ce)結果。樣(yang)本是(shi)否(fou)存在高(gao)豐(feng)度蛋白(bai)(bai)(bai)可以通過SDS-page膠(jiao)圖(tu)或(huo)者(zhe)相關文獻明確。
Q10. 為什么有(you)(you)些差異(yi)(yi)表達(da)基因在蛋(dan)白層面沒有(you)(you)相應的差異(yi)(yi)蛋(dan)白？
A10. 差(cha)異(yi)表達(da)的基因，其研(yan)究層(ceng)(ceng)次是轉錄(lu)組(zu)（RNA）層(ceng)(ceng)面，差(cha)異(yi)表達(da)的蛋白(bai)，其研(yan)究層(ceng)(ceng)次是蛋白(bai)組(zu)（蛋白(bai)質）層(ceng)(ceng)面，由于轉錄(lu)后(hou)調控(kong)、翻譯水(shui)(shui)平調控(kong)和(he)翻譯后(hou)水(shui)(shui)平調控(kong)的存在(zai)(zai)，RNA表達(da)水(shui)(shui)平和(he)蛋白(bai)表達(da)水(shui)(shui)平結果存在(zai)(zai)不一致性是一個(ge)公(gong)認(ren)的事實，通(tong)常相關性只有(you)～0.5左右(you)，甚至(zhi)更(geng)低(di)。
