2020-10-27
之前小(xiao)編給大家(jia)介紹了(le)做性狀定(ding)位簡便又(you)實用的混池分(fen)(fen)組分(fen)(fen)析法（BSA）,相信(xin)大家(jia)對這(zhe)種研究方法已經有了(le)一定(ding)的了(le)解，那大家(jia)的課(ke)題適(shi)不適(shi)合(he)采用BSA分(fen)(fen)析法?做BSA項目前，必須要了(le)解哪些知識點呢？
今天小編為(wei)大家整理了(le)那(nei)些做BSA項目前，你必須要了(le)解(jie)的知(zhi)識點，希望能解(jie)答您的疑惑！
Q1什么(me)課題適(shi)合BSA?
A1：理論上來講(jiang)，任何兩個(ge)具(ju)有相對性(xing)狀的(de)親本雜交后產生的(de)分離群(qun)體都適用(yong)于BSA分析(xi)。但在實際應用(yong)中，一般選擇研究(jiu)物種親本為純系(xi)，雜合度較低（判(pan)斷依據：自交親和(he)度是否高(gao)），研究(jiu)性(xing)狀（需要(yao)定(ding)位的(de)）最好為質量(liang)性(xing)狀或由少數幾個(ge)主效QTL控制的(de)數量(liang)性(xing)狀。
Q2為什么建議選(xuan)擇單一(yi)家系，不(bu)建議混合家系、自然群(qun)體(ti)以及(ji)林木等群(qun)體(ti)？
A2：混合家(jia)系、自然群(qun)體以及林木等為高雜合群(qun)體，遺(yi)傳多樣性(xing)較高，即使(shi)在很(hen)小一(yi)段(duan)DNA區域也有很(hen)大可(ke)能存在多種(zhong)等位基因基因型。DNA池中存在多種(zhong)基因型，將導致SNP檢(jian)測和基因型頻率計算可(ke)靠性(xing)降低(di)。
在雜交家系中，一段DNA一般只含有兩(liang)(liang)種來自兩(liang)(liang)個親本的(de)(de)等(deng)位基(ji)因，所以reads比(bi)對(dui)參考(kao)(kao)序列和(he)變異檢(jian)測(ce)相(xiang)對(dui)簡單。高雜合的(de)(de)群體混池后，DNA多(duo)樣性(xing)(xing)提(ti)高，reads多(duo)樣性(xing)(xing)自然也提(ti)高，比(bi)對(dui)參考(kao)(kao)基(ji)因組的(de)(de)錯(cuo)誤率以及SNP檢(jian)測(ce)的(de)(de)錯(cuo)誤率等(deng)都會提(ti)高。
基(ji)(ji)于(yu)雙親雜(za)交的(de)BSA-seq分析(xi)，大(da)部(bu)分突變基(ji)(ji)因型都是高頻的(de)（≥0.5），檢測(ce)相對容易。在(zai)MutMap中，有文章將頻率≤0.3的(de)SNP過濾掉(diao)。但(dan)在(zai)自(zi)然群(qun)體中，低頻SNP大(da)量存在(zai)，混池后，無法區(qu)分哪些(xie)是真實的(de)低頻SNP，哪些(xie)是測(ce)序或比對錯(cuo)誤(wu)導致的(de)SNP，會給(gei)數據分析(xi)帶(dai)來(lai)困(kun)難。
Q3群體構建時對親(qin)本有什么要(yao)求(qiu)？
A3：親(qin)本要(yao)選用盡量(liang)純的個體，可通過(guo)自交進(jin)行純化，兩(liang)個親(qin)本要(yao)在目(mu)標性狀上有顯著差異，但(dan)其(qi)他性狀盡量(liang)保(bao)持一致，以降低后期(qi)定位分(fen)析(xi)的干擾。
Q4親本(ben)為(wei)什么要求(qiu)目標性狀(zhuang)基(ji)因位(wei)點(dian)純合？
A4：BSA性狀定位(wei)(wei)的(de)(de)(de)核心原理(li)是(shi)檢測雙親的(de)(de)(de)SNP并計(ji)算子代(dai)池間全基因組水平的(de)(de)(de)SNP-index，如果親本不是(shi)純合，會(hui)(hui)導(dao)致子代(dai)SNP的(de)(de)(de)檢出率和SNP-index降低，如果要進行(xing)定位(wei)(wei)，則(ze)必然會(hui)(hui)降低篩(shai)選SNP-index的(de)(de)(de)閾(yu)值，會(hui)(hui)導(dao)致假陽(yang)性的(de)(de)(de)出現。在計(ji)算SNP-index的(de)(de)(de)過程(cheng)中，目前依(yi)據(ju)的(de)(de)(de)原則(ze)是(shi)以親本為參考，且(qie)篩(shai)選親本純合的(de)(de)(de)位(wei)(wei)點(dian)，計(ji)算子代(dai)池在這些位(wei)(wei)點(dian)的(de)(de)(de)SNP-index。
Q5對子代群體有什么(me)要求？
A5：理論上來(lai)說(shuo)，只要目標(biao)性(xing)狀(zhuang)不同的親本雜交后代產生了性(xing)狀(zhuang)分離都(dou)可(ke)以(yi)拿來(lai)做BSA，但是(shi)比較常用的群體有：F2、回交群體、重(zhong)組自交系(xi)等。
如(ru)果是質量性狀，子代的顯隱(yin)性個體(ti)比值可能有1:1、3:1等(deng)情況；數量性狀的話，子代性狀應當(dang)符合正態分布為(wei)佳，如(ru)果嚴重偏離，需要考慮是否有隱(yin)性致(zhi)死(si)基因產生了作用。
Q6為什么(me)群體要選擇F2、RILs群體？
A6：F2和RILs分別(bie)是定(ding)(ding)位(wei)控制質量性(xing)狀(zhuang)(zhuang)和數(shu)(shu)量性(xing)狀(zhuang)(zhuang)基(ji)因(yin)或QTL最常用(yong)的(de)群(qun)體。對(dui)于(yu)質量性(xing)狀(zhuang)(zhuang)來說，F2完全可以滿(man)足(zu)分析需求，縮短群(qun)體構建(jian)周期。而(er)數(shu)(shu)量性(xing)狀(zhuang)(zhuang)通(tong)常由多(duo)(duo)基(ji)因(yin)控制，而(er)且(qie)表型易受環境(jing)影響，用(yong)RILs可以進行多(duo)(duo)次表型調查，獲得(de)準確的(de)表型數(shu)(shu)據。對(dui)于(yu)基(ji)因(yin)組較(jiao)(jiao)小(xiao)較(jiao)(jiao)簡單的(de)一(yi)些物(wu)種，如果目標(biao)數(shu)(shu)量性(xing)狀(zhuang)(zhuang)是由個(ge)別(bie)主(zhu)效QTL控制，也可使(shi)用(yong)F2。此外(wai)，F1代僅用(yong)于(yu)林木或魚(yu)類(lei)等親本(ben)雜合度較(jiao)(jiao)高(gao)的(de)物(wu)種中基(ji)因(yin)的(de)定(ding)(ding)位(wei)。這(zhe)類(lei)物(wu)種本(ben)身就不適合BSA。如果堅持用(yong)F1代做林木或魚(yu)類(lei)等的(de)基(ji)因(yin)定(ding)(ding)位(wei)，風險較(jiao)(jiao)高(gao)，可能(neng)出(chu)現較(jiao)(jiao)多(duo)(duo)的(de)假陽性(xing)，甚至會出(chu)現無法定(ding)(ding)位(wei)出(chu)候選區域(yu)的(de)情(qing)況。
Q7子代取多少樣品才(cai)夠呢？
A7：子代的取(qu)樣應當符合(he)以下原(yuan)則(ze)：
定(ding)位質量性狀的，應(ying)該取盡可能多的隱性個(ge)(ge)體(ti)，最低(di)不能低(di)于(yu)20個(ge)(ge)，一般(ban)在30-50之間(jian)，然后取對應(ying)數量的顯性個(ge)(ge)體(ti)；
定位數(shu)量性(xing)狀的，一般是選擇最極端的各5%-10%性(xing)狀的個體，還(huan)可以(yi)將(jiang)子代的性(xing)狀數(shu)據做個類(lei)似如下(xia)的直方圖：
Q8子代群體規模不夠，應該優(you)先(xian)取極(ji)端還(huan)是優(you)先(xian)取數量？
A8：很多物種(zhong)的子代群體(ti)很難做到(dao)200個(ge)以上，就會(hui)出(chu)現極端個(ge)體(ti)不(bu)(bu)足20的情況，這時我們(men)建議(yi)寧可少取些(xie)樣品(pin)，也不(bu)(bu)要把性狀居中的樣品(pin)選擇(ze)進(jin)去，這些(xie)樣品(pin)只會(hui)對后期(qi)分(fen)析產生干(gan)擾。當(dang)然(ran)每一個(ge)池(chi)只有(you)十來個(ge)樣品(pin)的實驗，是(shi)否能夠得到(dao)滿意的結果，是(shi)存在一定(ding)風險(xian)的。
Q9如果F2單株DNA量(liang)不足(zu)該怎么辦？
A9：F2單株(zhu)(zhu)有(you)時(shi)由于取(qu)樣量(liang)少，提取(qu)的(de)DNA量(liang)較少，如果無法(fa)提供(gong)足(zu)夠的(de)DNA，可從該F2單株(zhu)(zhu)的(de)后代(dai)F3中，隨機選擇6~10株(zhu)(zhu)混提DNA來(lai)代(dai)替該F2。
Q10重測(ce)(ce)序(xu)時對親本和子代的(de)測(ce)(ce)序(xu)深度(du)要求(qiu)是多少？
A10：為(wei)保證SNP、InDel標記的準確性(xing)，測序(xu)應當保證一定的深度，親本建議不(bu)低(di)(di)于(yu)20×，混池應當結合取(qu)樣(yang)數量來定，平(ping)均每(mei)個樣(yang)品不(bu)低(di)(di)于(yu)1×，比(bi)如子(zi)代是30+30，那(nei)么每(mei)個子(zi)代混池的測序(xu)深度就不(bu)能低(di)(di)于(yu)30×，經(jing)費允許的話，可以再適當加深。
Q11參考基(ji)因(yin)組的質量有什(shen)么(me)要(yao)求？
A11：參考基(ji)因(yin)組組裝得越好，信(xin)(xin)息越全(quan)，注(zhu)釋(shi)文(wen)件(jian)信(xin)(xin)息也相對較(jiao)全(quan)；即便是草圖，如(ru)(ru)果scaffolds能有(you)染色體定(ding)位信(xin)(xin)息，對于后續基(ji)因(yin)定(ding)位和(he)候選(xuan)(xuan)基(ji)因(yin)注(zhu)釋(shi)都會更加(jia)精確，可以估計候選(xuan)(xuan)區域的(de)大小(xiao)。沒有(you)組裝到(dao)染色體的(de)參考基(ji)因(yin)組分(fen)析(xi)思路是一樣(yang)的(de)，但只能得到(dao)某(mou)個或(huo)某(mou)些scaffolds中的(de)SNPs與性狀(zhuang)相關(guan)，無法估計候選(xuan)(xuan)區域的(de)大小(xiao)，但是如(ru)(ru)果組裝結果差的(de)話，有(you)可能遺漏掉(diao)一些候選(xuan)(xuan)基(ji)因(yin)。
Q12為(wei)什么不用具(ju)有極(ji)端性狀的親本直接做混池測(ce)序而需要進行雜交群體(ti)構(gou)建？
A12：親本之間遺傳背(bei)景(jing)具有(you)一定差(cha)異，除了關注的(de)目標(biao)(biao)性(xing)狀位(wei)(wei)點的(de)差(cha)異外，其他的(de)基因(yin)(yin)位(wei)(wei)點肯定也會存在(zai)差(cha)異，而(er)且親本都(dou)為純(chun)系，不存在(zai)混(hun)池(chi)一說，所有(you)SNP位(wei)(wei)點的(de)△SNP-index都(dou)是(shi)1。雙親雜交后(hou)代(dai)中由于染色體自由組(zu)合和遺傳重組(zu)，非(fei)目標(biao)(biao)性(xing)狀基因(yin)(yin)位(wei)(wei)點的(de)變異在(zai)極端性(xing)狀的(de)兩(liang)個子代(dai)池(chi)中均有(you)分布，通過兩(liang)個混(hun)池(chi)的(de)頻率差(cha)異，可消除目標(biao)(biao)性(xing)狀外背(bei)景(jing)差(cha)異的(de)干擾。
Q13只測2個子代池是否可行(xing)？
A13：如果研究(jiu)性(xing)(xing)狀(zhuang)(zhuang)為(wei)EMS誘變的(de)質量性(xing)(xing)狀(zhuang)(zhuang)，同時所(suo)研究(jiu)物種已(yi)有組(zu)裝質量較(jiao)好的(de)參(can)(can)考基(ji)因(yin)組(zu)，研究(jiu)品系(xi)親(qin)本(ben)為(wei)普(pu)通野生型(xing)，與參(can)(can)考基(ji)因(yin)組(zu)品系(xi)為(wei)相同生態(tai)型(xing)的(de)情況下(xia)，是可(ke)以只測(ce)2個子代池(chi)(chi)的(de)，以參(can)(can)考基(ji)因(yin)組(zu)為(wei)一(yi)致(zhi)性(xing)(xing)序列(lie)計(ji)算SNP-index。但(dan)是一(yi)般情況下(xia)，由于(yu)參(can)(can)考基(ji)因(yin)組(zu)和(he)所(suo)研究(jiu)品種之間原本(ben)就可(ke)能(neng)存在(zai)較(jiao)大的(de)差異(yi)，會導致(zhi)出現大量假陽(yang)(yang)性(xing)(xing)SNP。所(suo)以，還是推薦測(ce)雙親(qin)和(he)2個子代池(chi)(chi)，盡可(ke)能(neng)排除背景噪(zao)聲，減少假陽(yang)(yang)性(xing)(xing)SNP。
如果研究(jiu)的性(xing)狀是(shi)數量性(xing)狀，最好是(shi)2個親本和2個子(zi)代(dai)(dai)池(chi)都(dou)測(ce)，其次是(shi)1個親本和2個子(zi)代(dai)(dai)池(chi)。不推薦只(zhi)測(ce)2個子(zi)代(dai)(dai)池(chi)，會出現較多(duo)假陽(yang)性(xing)SNP。
Q14簡化基(ji)因組測序能用于BSA性狀定位嗎？
A14：簡化基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)BSA技(ji)術(shu)僅能捕獲(huo)全基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)的(de)1%~10%，如果研(yan)究物種基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)較大，對(dui)(dui)于微效多基(ji)(ji)因(yin)(yin)控制的(de)數量性(xing)(xing)狀與目(mu)標性(xing)(xing)狀相關(guan)位(wei)點(dian)(dian)很多，可能會捕獲(huo)到個別(bie)位(wei)點(dian)(dian)，但(dan)會遺(yi)漏大部分位(wei)點(dian)(dian)，對(dui)(dui)后續(xu)研(yan)究不(bu)利。對(dui)(dui)質量性(xing)(xing)狀或由主效基(ji)(ji)因(yin)(yin)控制的(de)數量性(xing)(xing)狀，簡化基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)BSA風(feng)險很高(gao)，建議將親(qin)本和群體都(dou)做簡化基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)序，構建全基(ji)(ji)因(yin)(yin)連鎖圖譜(pu)進行性(xing)(xing)狀基(ji)(ji)因(yin)(yin)定位(wei)。
以上就是(shi)我們精心整理的BSA項目(mu)前你(ni)應該了解(jie)的知(zhi)識點(dian)，希望(wang)能(neng)夠(gou)幫(bang)助大家解(jie)決項目(mu)前期的一些疑惑，選擇更適合自己群體的研究方(fang)法。
下期我們將繼續推(tui)出BSA問答系列(lie)-結果解讀篇，總結BSA項目中數據挖(wa)掘的(de)各種問題，下周不(bu)見不(bu)散咯！
