2020-10-29
什(shen)么是SNP？
SNP全(quan)稱(cheng)Single Nucleotide Polymorphism，即單核苷酸(suan)多(duo)態(tai)性(xing)，是(shi)(shi)指在基因組(zu)DNA序列中由于(yu)單個(ge)(ge)(ge)核苷酸(suan)（A，T，C和(he)G）的突變(bian)(bian)引(yin)起的多(duo)態(tai)性(xing)。一(yi)個(ge)(ge)(ge)SNP表示基因組(zu)某個(ge)(ge)(ge)位(wei)點(dian)有(you)一(yi)個(ge)(ge)(ge)核苷酸(suan)的變(bian)(bian)化，源于(yu)單個(ge)(ge)(ge)堿基的轉(zhuan)換(huan)，顛(dian)換(huan)，插入和(he)缺失。理論上講，SNP既(ji)可(ke)能(neng)是(shi)(shi)二等(deng)位(wei)多(duo)態(tai)性(xing)，也可(ke)能(neng)是(shi)(shi)3個(ge)(ge)(ge)或4個(ge)(ge)(ge)等(deng)位(wei)多(duo)態(tai)性(xing)，但(dan)實際上，后兩者(zhe)非常(chang)(chang)少見，幾(ji)乎可(ke)以忽略。通常(chang)(chang)所說的SNP都(dou)是(shi)(shi)二等(deng)位(wei)多(duo)態(tai)性(xing)的。這種變(bian)(bian)異(yi)可(ke)能(neng)是(shi)(shi)轉(zhuan)換(huan)(C T，在其(qi)(qi)互補鏈(lian)上則為GA)，也可(ke)能(neng)是(shi)(shi)顛(dian)換(huan)(CA，GT，CG，AT)。轉(zhuan)換(huan)的發生率總是(shi)(shi)明顯(xian)高(gao)于(yu)其(qi)(qi)它幾(ji)種變(bian)(bian)異(yi)，具有(you)轉(zhuan)換(huan)型變(bian)(bian)異(yi)的SNP約(yue)占2/3。
為啥要檢測SNP分型呢？
常見的(de)(de)SNP既可(ke)以(yi)出現(xian)在基(ji)因編碼(ma)區，也可(ke)以(yi)出現(xian)在非編碼(ma)區，雖然發生在編碼(ma)區的(de)(de)概率相對較小，但會影響基(ji)因的(de)(de)功能，導(dao)致(zhi)生物(wu)性(xing)(xing)狀(zhuang)改(gai)變，在遺(yi)傳(chuan)性(xing)(xing)疾(ji)(ji)病的(de)(de)研(yan)究中(zhong)具(ju)有(you)非常重(zhong)要(yao)的(de)(de)意義。SNP作為(wei)第三代(dai)遺(yi)傳(chuan)標記，其(qi)分布密度(du)高，遍(bian)布于(yu)整個動(dong)物(wu)和人類基(ji)因組中(zhong)；與功能基(ji)因具(ju)有(you)高度(du)關聯性(xing)(xing);突變率低，遺(yi)傳(chuan)穩(wen)定性(xing)(xing)強(qiang)；檢測(ce)通量高便于(yu)自動(dong)化分析(xi)。某(mou)些(xie)SNP位點并不直接(jie)與疾(ji)(ji)病基(ji)因的(de)(de)表(biao)達相關聯，但因為(wei)它與某(mou)些(xie)致(zhi)病基(ji)因相鄰，所以(yi)成(cheng)為(wei)重(zhong)要(yao)的(de)(de)遺(yi)傳(chuan)標記。可(ke)用于(yu)以(yi)下研(yan)究：
如(ru)何獲得(de)未(wei)知的SNP位點呢？
①利用高通量測序技術
通過(guo)與參考基因組（轉錄(lu)組亦是同理）進(jin)行比較，獲得該物種或群體在(zai)全基因組范(fan)圍內的遺傳變異信息(xi)（SNP、InDel、SV、CNV）等。
②通過直接測序法查找SNP位(wei)點
許多老師在做完測序后會得到大量的SNP（尤其是在做QTL定(ding)位(wei)或者BSA定(ding)位(wei)時(shi)），這些SNP該(gai)如何進行驗證(zheng)呢？
下面小派(pai)君就給大家介紹幾種SNP驗證的(de)方法（派(pai)森諾可以(yi)提供這些服務(wu)，有意向的(de)老師
1）直接測序法
直接測序法是目前最直觀，準確性(xing)相(xiang)對而言最高的(de)(de)SNP分型方法，是金標準。在SNP位點兩側設(she)計擴(kuo)增(zeng)引物，擴(kuo)出目標SNP所在的(de)(de)片段，通過(guo)一代測序的(de)(de)結果來驗證SNP位點堿(jian)基情況。
原(yuan)始(shi)測序SNP位點圖
2)SNaPshot技術
基于熒(ying)光(guang)標記(ji)單(dan)堿(jian)基延(yan)伸(shen)原(yuan)理的(de)分型技術，含有測(ce)序酶、四種熒(ying)光(guang)標記(ji)ddNTP、緊臨多(duo)態位點5’端(duan)的(de)不(bu)同(tong)長度延(yan)伸(shen)引物(wu)和PCR產物(wu)模(mo)板的(de)反(fan)應體(ti)系中，引物(wu)延(yan)伸(shen)一(yi)個(ge)堿(jian)基即終(zhong)止(zhi)，經(jing)ABI測(ce)序儀檢測(ce)后，根據峰的(de)移動位置確定該延(yan)伸(shen)產物(wu)對應的(de)SNP位點，根據峰的(de)顏(yan)色可得知摻入的(de)堿(jian)基種類，從(cong)而確定該樣本(ben)的(de)基因(yin)型。
SNP位點分型圖(tu)
3)PCR-LDR 分型技(ji)術(shu)
LDR是利用高溫連(lian)接(jie)酶(mei)實現對基因多態性位點(dian)的(de)識別。高溫連(lian)接(jie)酶(mei)一旦檢測到DNA與互補的(de)兩條寡聚核(he)苷酸接(jie)頭對應處存(cun)在著(zhu)基因點(dian)突變(bian)類型的(de)堿基錯配，則連(lian)接(jie)反應就不(bu)能進行。
SNP位點分型圖
4)TaqMan探(tan)針法
針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)對染色體上的(de)(de)不同的(de)(de)SNP位(wei)點別(bie)設計1對PCR引物(wu)和(he)(he)TaqMan探(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)，進行實時熒光PCR擴增，該(gai)探(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)5’端(duan)和(he)(he)3’端(duan)分(fen)別(bie)標記(ji)一個報(bao)告熒光基(ji)團和(he)(he)一個淬滅熒光基(ji)團。當溶液中(zhong)有PCR產(chan)物(wu)時，該(gai)探(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)與模(mo)板退火，即產(chan)生(sheng)了適合于核酸(suan)外切酶活性(xing)的(de)(de)底物(wu)，從(cong)而將探(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)5’端(duan)連接的(de)(de)熒光分(fen)子從(cong)探(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)上切割下來，破(po)壞兩熒光分(fen)子間(jian)的(de)(de)PRET，發出熒光。通常用于少量SNP位(wei)點分(fen)析。
FAM:藍色，基因型T；VIC：紅色，基因型C
5)焦磷酸測(ce)序法
焦(jiao)磷酸測(ce)(ce)序(xu)技術是一種(zhong)(zhong)基于四(si)(si)種(zhong)(zhong)酶（DNA聚合(he)酶、 硫酸化酶、熒光素酶和(he)雙磷酸酶）的(de)級聯反應(ying)來進行定量序(xu)列分析的(de)技術。在整個(ge)反應(ying)體系中(zhong)， 以 PCR產物(wu)的(de)一條單鏈(lian)(lian)為模(mo)板(ban)，與測(ce)(ce)序(xu)引(yin)物(wu)退火(huo)結合(he)后，按照事先計算好的(de)順(shun)序(xu)將(jiang)四(si)(si)種(zhong)(zhong) dNTP 依次加(jia)到(dao)樣品(pin)中(zhong)。如果加(jia)入的(de)這種(zhong)(zhong) dNTP 與測(ce)(ce)序(xu)引(yin)物(wu)3’下游+1位所(suo)對應(ying)的(de)模(mo)板(ban)鏈(lian)(lian)上(shang)的(de)堿基互(hu)補(bu)，就(jiu)會發(fa)生一系列酶的(de)級聯反應(ying)。通過(guo)測(ce)(ce)序(xu)結果可(ke)以直觀的(de)看出各位點基因型的(de)占(zhan)比，其可(ke)重復性和(he)精(jing)確性能與Sanger DNA測(ce)(ce)序(xu)法相媲美，而速度卻大大的(de)提(ti)高(gao)。
焦磷(lin)酸測序結果展示
SNP分(fen)子標記多態性高、密度(du)大(da)、遺傳穩定(ding)性高、易于實現(xian)自動化高通量(liang)基因分(fen)型(xing)，但現(xian)階段仍存在(zai)一(yi)些不(bu)(bu)足，不(bu)(bu)過隨(sui)著SNP分(fen)型(xing)技(ji)術(shu)的(de)不(bu)(bu)斷改進，各類數據(ju)庫的(de)逐步完善，SNP在(zai)各方(fang)(fang)面(mian)研究應用的(de)廣度(du)和深度(du)將不(bu)(bu)斷推進。不(bu)(bu)同的(de)類型(xing)需(xu)要使用不(bu)(bu)同的(de)方(fang)(fang)法，不(bu)(bu)同的(de)方(fang)(fang)法努努力總是可以達(da)到大(da)家的(de)預(yu)期(qi)，歡迎大(da)家咨詢(xun)！
