2020-11-05
眾所周知，文(wen)庫制備(bei)過程中，一(yi)般都(dou)需要對(dui)文(wen)庫片段進行分選，使得文(wen)庫片段大小符合預(yu)期，然(ran)后上機測序，這(zhe)樣才能得到令人滿(man)意(yi)的測序結果(guo)。
下面來(lai)簡單(dan)介紹一下幾(ji)種常見的(de)文(wen)庫(ku)分(fen)選方式
首(shou)先是傳統的手工(gong)切(qie)(qie)(qie)膠回(hui)收(shou)(shou)。它的原理是不同(tong)(tong)大小(xiao)(xiao)、不同(tong)(tong)形狀(zhuang)和不同(tong)(tong)構(gou)象的DNA分子(zi)在相(xiang)同(tong)(tong)的電(dian)泳條(tiao)件下(如(ru)凝膠濃度、電(dian)流、電(dian)壓、緩沖液(ye)等)，有不同(tong)(tong)的遷移率，所以可通過電(dian)泳使其分離。它的優點是花費的費用比(bi)較少。但是切(qie)(qie)(qie)膠回(hui)收(shou)(shou)也(ye)有著無法(fa)忽(hu)略(lve)的缺點，比(bi)如(ru)使用的試劑可能(neng)(neng)對(dui)人體有害；而且實驗操作也(ye)比(bi)較繁瑣，耗時長；切(qie)(qie)(qie)膠時回(hui)收(shou)(shou)的片段大小(xiao)(xiao)不精(jing)確，可能(neng)(neng)有小(xiao)(xiao)分子(zi)量污染等。最主要的是普(pu)通的切(qie)(qie)(qie)膠回(hui)收(shou)(shou)只能(neng)(neng)回(hui)收(shou)(shou)中小(xiao)(xiao)片段，不能(neng)(neng)回(hui)收(shou)(shou)三代(dai)平臺所需的大片段。因此手工(gong)切(qie)(qie)(qie)膠回(hui)收(shou)(shou)正在被其他更安全簡便的方(fang)法(fa)替代(dai)。
其次是磁(ci)珠(zhu)分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)，磁(ci)珠(zhu)分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)在二代測序中應用比較(jiao)廣泛(fan)。原理是磁(ci)珠(zhu)會優(you)先(xian)抓取(qu)較(jiao)大的核酸片段，在分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)過程中，通(tong)過控制(zhi)兩輪磁(ci)珠(zhu)的加入量來(lai)分(fen)(fen)選(xuan)(xuan)到(dao)所(suo)需要大小(xiao)的文(wen)庫片段（如下圖）。
而(er)在三(san)代(dai)測(ce)序中，為了更(geng)有效(xiao)的回收高分(fen)子量的目的片段(duan)，更(geng)多地使用Sage Science （//sagescience.com/products/bluepippin/）的BluePippin全自動核酸電泳系(xi)統(tong)。Bluepippin可以幫助(zhu)三(san)代(dai)測(ce)序精(jing)確去(qu)除文庫中小分(fen)子DNA片段(duan)，提升測(ce)序數據的有效(xiao)讀長(chang)，已經成為三(san)代(dai)測(ce)序的重要輔助(zhu)設備。
BluePippin配備了脈沖場電泳，能分辨和收集高(gao)分子量(liang)DNA。對于長讀長的(de)三(san)代(dai)測(ce)序來說(shuo)，其中High-Pass過濾程序可(ke)以(yi)收集大(da)于某(mou)一大(da)小(xiao)閾(yu)值的(de)所有片(pian)段，這(zhe)個閾(yu)值可(ke)以(yi)自由設置。只要在(zai)軟件中輸(shu)入目(mu)標片(pian)段的(de)特定長度值或長度值范圍，儀(yi)器(qi)運行結束(shu)后就可(ke)以(yi)從buffer中回(hui)收目(mu)標片(pian)段。每塊(kuai)預(yu)制(zhi)膠最多能運行5個樣(yang)品(pin)（包含一個外(wai)參marker），并且(qie)不會產生(sheng)交叉污染(ran)。
文(wen)庫(ku)分(fen)選操作基(ji)本上是儀器自動(dong)化進行的(de)(de)，只需幾分(fen)鐘(zhong)的(de)(de)手工操作，待分(fen)選完成以后，即可從收集孔buffer中回收目的(de)(de)片段。
在BioRxiv發表(biao)的(de)文章《Highly accurate long-read HiFi sequencing data for five complex genomes》
（//www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.04.077180v1.full）中科(ke)學家就根據需要用了BluePippin和SageELF（后(hou)文會介紹）來分選5個不(bu)同(tong)物種(zhong)的(de)文庫(ku)，從而得到符合預期片段(duan)大(da)小(xiao)的(de)HIFI文庫(ku)，然后(hou)上機(ji)測序。從最終結果(guo)看，HIFI reads的(de)準確性超(chao)過99.5%，測序讀(du)長范圍根據文庫(ku)大(da)小(xiao)分布(bu)不(bu)同(tong)為10.5Kb到21.7Kb。
SageELF 也是Sage Science推出的(de)(de)一款全自(zi)(zi)動(dong)電泳(yong)系(xi)統(tong)，可(ke)(ke)以收集(ji)(ji)來(lai)自(zi)(zi)單個(ge)(ge)(ge)(ge)樣本的(de)(de)12個(ge)(ge)(ge)(ge)連(lian)續組分(fen)，SageELF把(ba)DNA或蛋白樣品(pin)按照分(fen)子量大(da)小進行(xing)區分(fen)，隨后將(jiang)整個(ge)(ge)(ge)(ge)樣品(pin)或部分(fen)樣品(pin)劃分(fen)成12個(ge)(ge)(ge)(ge)連(lian)續的(de)(de)組分(fen)。這個(ge)(ge)(ge)(ge)系(xi)統(tong)同樣也配備(bei)了脈沖場電泳(yong)，可(ke)(ke)以用于(yu)分(fen)辨(bian)收集(ji)(ji)大(da)分(fen)子量DNA。分(fen)隔片(pian)段(duan)大(da)小的(de)(de)范圍由(you)軟件自(zi)(zi)動(dong)估(gu)算(suan)和調整，運行(xing)結束后就可(ke)(ke)以從buffer中回收目標片(pian)段(duan)。單塊(kuai)預制膠可(ke)(ke)以運行(xing)一個(ge)(ge)(ge)(ge)樣本，一次(ci)運行(xing)可(ke)(ke)處理1塊(kuai)或2塊(kuai)預制膠。
同樣在BioRxiv發表的文章《Highly-accurate long-read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome》
（//www.biorxiv.org/content/10.1101/519025v1.full）中(zhong)，科學家(jia)們使用CCS（Circular Consensus Sequencing，環(huan)化一致性(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)）測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)方法進行了人(ren)類(lei)基(ji)因(yin)組(zu)的(de)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)與組(zu)裝。根據文(wen)章的(de)結(jie)果(guo)顯示，從(cong)頭測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)組(zu)裝產(chan)生(sheng)了一個連續(xu)且高精度的(de)基(ji)因(yin)組(zu)，N50超(chao)過15Mb，一致性(xing)達(da)到99.998%。識別出的(de)基(ji)因(yin)組(zu)變(bian)異 SNVs (99.91%), indels (95.98%), 和(he)結(jie)構變(bian)異 (95.99%)。幾(ji)乎所(suo)有的(de)變(bian)異(99.64%)都被定位到單倍型（haplotypes）染色體上(shang)。人(ren)類(lei)基(ji)因(yin)組(zu)信息的(de)Q30分析，在三代測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)儀上(shang)達(da)到二代測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)儀的(de)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)精度。在該文(wen)章的(de)研究工作中(zhong)，SageELF作為高精度的(de)DNA片段回收儀，實現了對15kb的(de)準確(que)分選(xuan)和(he)高效(xiao)回收，表現出優(you)異的(de)可重復性(xing)和(he)易用性(xing)。
不同文(wen)庫(ku)(ku)分(fen)選(xuan)(xuan)方法其(qi)實并無高(gao)下之分(fen)，根據實際情(qing)況，綜(zong)合實驗效率(lv)和(he)成本(ben)考量，選(xuan)(xuan)擇合適的文(wen)庫(ku)(ku)分(fen)選(xuan)(xuan)方法，使得(de)最后上機測序(xu)結果(guo)滿足客戶(hu)要求，就是好的文(wen)庫(ku)(ku)分(fen)選(xuan)(xuan)方法。
