2020-11-09
1、串聯質(zhi)譜的(de)原理(li)？
質(zhi)譜法(fa)(MS)即用電場(chang)和磁(ci)場(chang)將運動(dong)的(de)(de)(de)(de)離(li)子(zi)(zi)(zi)，按它們的(de)(de)(de)(de)質(zhi)荷比分離(li)后測(ce)量(liang)各(ge)種離(li)子(zi)(zi)(zi)譜峰的(de)(de)(de)(de)強度而實現分析目(mu)的(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)一(yi)種分析方(fang)法(fa)。測(ce)出離(li)子(zi)(zi)(zi)準確質(zhi)量(liang)即可確定離(li)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)化合物(wu)組成，質(zhi)譜儀(yi)就是用來測(ce)定氣態離(li)子(zi)(zi)(zi)質(zhi)荷比（m/z）的(de)(de)(de)(de)儀(yi)器(qi)。
一(yi)(yi)級質(zhi)譜：檢(jian)測所(suo)有帶電離(li)子的質(zhi)荷(he)比(bi)和強度，形成一(yi)(yi)級譜圖。一(yi)(yi)級質(zhi)譜中的信(xin)號(hao)為(wei)母(mu)離(li)子肽段(duan)信(xin)號(hao)。二級質(zhi)譜：按照(zhao)一(yi)(yi)定方式選擇母(mu)離(li)子肽段(duan)，將其進一(yi)(yi)步解離(li)，分析所(suo)形成的子離(li)子的質(zhi)荷(he)比(bi)和強度，形成二級譜圖。串(chuan)聯(lian)質(zhi)譜是一(yi)(yi)種特異性更高，更準確的物質(zhi)定性與定量技術(shu)。
2、DDA 與DIA 技術？
目(mu)前流行的蛋白(bai)質組學研究手段(duan)，如(ru) iTRAQ / TMT、Label-free采用的都是數據依賴性的掃(sao)描模式 DDA，二(er)級質譜只能夠(gou)選(xuan)擇一級質譜中特(te)定(ding)數量的肽(tai)段(duan)分子(zi)（如(ru)信號強度最強的Top20的離子(zi)）進行碎裂，所以說會造成信息遺漏。
與(yu)之相對(dui)的，就是(shi)最(zui)近發展的一種新的質(zhi)譜數據采集方式——DIA。DIA可以依次對(dui)特(te)定質(zhi)量范圍內的所(suo)(suo)有母離子進行碎裂，采集所(suo)(suo)有母離子的碎片離子信(xin)(xin)息進行蛋(dan)白定性(xing)和(he)定量，不(bu)會造成低(di)豐度蛋(dan)白信(xin)(xin)息的丟(diu)失；對(dui)于復雜蛋(dan)白樣本，特(te)別(bie)是(shi)低(di)豐度蛋(dan)白具有更(geng)優異的重現(xian)性(xing)。
相對于傳統的DDA技術，其優勢主要體現在：
1樣本重(zhong)復性好
2蛋白質(zhi)覆(fu)蓋率、定量準確性高
3通量無上限，適合大規模蛋白定量分析
3、蛋白組學數據(ju)庫選擇？
有參考基因組物種(zhong)：選(xuan)用對(dui)應物種(zhong)參考基因組的(de)Protein的(de)注釋文件即可，優先推薦(jian)使用。
小鼠(shu)：//asia.ensembl.org/Mus musculus/Info/Index
水稻：//plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index#
無參考基因組物種：
1、可以(yi)選擇近緣(yuan)物(wu)種的參考基因組作為檢(jian)索數據庫；
2、做無參(can)轉(zhuan)錄(lu)組測序(xu)，將轉(zhuan)錄(lu)組測序(xu)得到的unigene翻譯成蛋白序(xu)列作為蛋白質組學(xue)分析的理論數據庫(ku)。
4、什么是(shi)蛋白質搜庫？
樣本經過蛋白質提取、酶解和質譜儀上機檢測之后，會產生一系列的譜圖。那如何對這些譜圖進行鑒定呢？是通過對實驗得到的這些質譜圖與數據庫進行比對，利用軟件對質譜圖進行自動化的分析，得到肽段序列，通過肽段序列實現蛋白質的定性與定量。
譜圖-肽(tai)段-蛋(dan)白質(zhi)
5、檢索時為什么同一個編號對應了很多蛋白質(zhi)？
因為(wei)一(yi)個(ge)蛋白家族中常常含有幾(ji)個(ge)或(huo)多(duo)個(ge)同源性(xing)(xing)很(hen)高的蛋白質(zhi)，這些蛋白質(zhi)被酶(mei)切(qie)之后(hou)，大概率(lv)會(hui)產生很(hen)多(duo)相同的肽(tai)段，系統在進行定性(xing)(xing)分(fen)析時(shi)，就會(hui)將這些肽(tai)段均(jun)歸于(yu)得分(fen)最高的蛋白質(zhi)，其他同源蛋白則不計分(fen)，而且這些同源蛋白都采用同一(yi)編號(hao)。
6、什么是(shi)修飾蛋白組學？有哪(na)些類型(xing)？
修(xiu)飾(shi)(shi)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)組學(xue)是將修(xiu)飾(shi)(shi)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)或肽段富集方(fang)法與蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)組學(xue)相(xiang)對(dui)定量的技術結合起來(lai)，不僅可以鑒定翻(fan)譯后(hou)修(xiu)飾(shi)(shi)位(wei)點，還對(dui)不同樣本(ben)中翻(fan)譯后(hou)修(xiu)飾(shi)(shi)的程(cheng)度進行(xing)相(xiang)對(dui)定量，實(shi)現大規模(mo)的修(xiu)飾(shi)(shi)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)組學(xue)定性和定量分析，從而進一步揭示某些生理、病理機(ji)制。蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)翻(fan)譯后(hou)修(xiu)飾(shi)(shi)類(lei)型多(duo)樣，常見的有(you)磷酸化(hua)、N-糖基化(hua)、乙(yi)酰化(hua)、泛(fan)素(su)化(hua)、甲基化(hua)。
修(xiu)飾富集
7、蛋(dan)白質修(xiu)飾檢(jian)測的(de)原理？
蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)氨(an)基(ji)酸(suan)序列的(de)(de)(de)特定(ding)(ding)位置可以(yi)與化學基(ji)團或者小分(fen)(fen)子量的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)共價鍵結合從(cong)而發(fa)生(sheng)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)翻譯(yi)后(hou)(hou)(hou)修(xiu)(xiu)飾(shi)（post-translational modifications，PTM），相(xiang)較(jiao)于沒有發(fa)生(sheng)修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)，PTMs會導致特定(ding)(ding)序列分(fen)(fen)子量的(de)(de)(de)增加，通過高精(jing)度的(de)(de)(de)質(zhi)譜檢測就(jiu)可以(yi)檢測到(dao)特定(ding)(ding)的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)翻譯(yi)后(hou)(hou)(hou)修(xiu)(xiu)飾(shi)。質(zhi)譜可以(yi)分(fen)(fen)辨蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)修(xiu)(xiu)飾(shi)前(qian)后(hou)(hou)(hou)分(fen)(fen)子量上的(de)(de)(de)變化，因此只要知道靶蛋(dan)白(bai)(bai)翻譯(yi)后(hou)(hou)(hou)修(xiu)(xiu)飾(shi)前(qian)后(hou)(hou)(hou)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子量的(de)(de)(de)精(jing)確變化，就(jiu)能對任(ren)何翻譯(yi)后(hou)(hou)(hou)修(xiu)(xiu)飾(shi)方(fang)式進(jin)行鑒定(ding)(ding)和定(ding)(ding)量。
8、蛋白修飾組(zu)學選用技(ji)術(shu)？
定(ding)量磷酸(suan)化(hua)蛋白質組(zu)：iTRAQ、TMT、Label-free；
定量N糖基化(hua)蛋(dan)白(bai)(bai)質組(zu)、定量泛素化(hua)蛋(dan)白(bai)(bai)質組(zu)、定量乙酰(xian)化(hua)蛋(dan)白(bai)(bai)質組(zu)以及定量甲基化(hua)蛋(dan)白(bai)(bai)質組(zu)分析：Label-free（不同類型對應不同抗體）。
修(xiu)飾(shi)(shi)組學(xue)分析是對(dui)發生修(xiu)飾(shi)(shi)的(de)(de)蛋白(bai)質或肽段(duan)進行(xing)富(fu)集然后上機檢測，跟普(pu)通蛋白(bai)定量(liang)(liang)(liang)組學(xue)相比，如果要標記的(de)(de)話(hua)樣本(ben)的(de)(de)需求量(liang)(liang)(liang)會很大，目(mu)前修(xiu)飾(shi)(shi)蛋白(bai)組項目(mu)一般labelfree定量(liang)(liang)(liang)會更準確。
9、GO和(he)KEGG注釋(shi)與功能富集(ji)分析(xi)區別(bie)？
1、GO和(he)KEGG區別：
GO (//www.geneontology.org/)的全稱是 Gene Ontology，從以下三個(ge)方面(mian)描述生物(wu)體中基(ji)因和基(ji)因產物(wu)的屬(shu)性：細胞組分、分子功能、生物(wu)過(guo)程。
KEGG 數據(ju)庫 (//www.genome.jp/kegg/) 是常用于通(tong)路研究(jiu)的數據(ju)庫之一，它收錄了新(xin)陳(chen)代謝，遺(yi)傳信(xin)息(xi)(xi)加(jia)工，環(huan)境信(xin)息(xi)(xi)加(jia)工，細(xi)胞(bao)過程，生物體系統，人類(lei)疾病(bing)以及(ji)藥物開發等多(duo)個方面的通(tong)路信(xin)息(xi)(xi)。
舉一個例子看GO和KEGG注釋(shi)區別，如某一個蛋白質，GO 只能將它(ta)(ta)注釋(shi)到與檸檬(meng)酸(suan)循(xun)(xun)環有關；而 KEGG 則可以(yi)將它(ta)(ta)注釋(shi)到檸檬(meng)酸(suan)循(xun)(xun)環通路中的某一個環節。
2、注釋(shi)與(yu)富集(ji)分(fen)析區別：
但(dan)是對(dui)于高(gao)通(tong)量組學來(lai)說，了解哪一(yi)些功能(neng)(neng)或生(sheng)物學途(tu)徑受到(dao)生(sheng)物學處理的顯(xian)著影響是首要任務。GO富(fu)(fu)集分析(xi)是指通(tong)過Fisher精(jing)確(que)檢驗來(lai)評價(jia)某個GO功能(neng)(neng)條目(mu)的蛋白質富(fu)(fu)集度的顯(xian)著性水平(ping)，從而找到(dao)所有差異表(biao)達(da)蛋白質富(fu)(fu)集的功能(neng)(neng)類別(bie)。KEGG通(tong)路富(fu)(fu)集分析(xi)方法與(yu)GO富(fu)(fu)集分析(xi)相似，即以KEGG通(tong)路為單位，得到(dao)受顯(xian)著影響的代謝和(he)信號(hao)轉(zhuan)導(dao)途(tu)徑，這些被顯(xian)著富(fu)(fu)集的 GO 條目(mu)或通(tong)路往往涉及到(dao)研究者最為關心(xin)的生(sheng)物學功能(neng)(neng)。
10、生物(wu)學重復(fu)和技術重復(fu)的(de)區(qu)別？
生物學(xue)重(zhong)(zhong)復(fu)(fu)是(shi)指用同一(yi)來(lai)源(yuan)獨立制備的(de)(de)(de)(de)(de)樣本，或者不(bu)同來(lai)源(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)樣本（不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)組織(zhi)，或者一(yi)個(ge)細胞系(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)同培養物）進行(xing)相同處理而(er)(er)進行(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)實驗(yan)；而(er)(er)技(ji)術重(zhong)(zhong)復(fu)(fu)是(shi)指同一(yi)樣品進行(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)多次相同實驗(yan)，與生物學(xue)重(zhong)(zhong)復(fu)(fu)相比，技(ji)術重(zhong)(zhong)復(fu)(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)測量變異程度較小。但是(shi)技(ji)術重(zhong)(zhong)復(fu)(fu)不(bu)是(shi)完全獨立的(de)(de)(de)(de)(de)，取平(ping)均值不(bu)能去除(chu)共有的(de)(de)(de)(de)(de)系(xi)統偏差。總的(de)(de)(de)(de)(de)來(lai)說，生物學(xue)重(zhong)(zhong)復(fu)(fu)用于研(yan)究群體的(de)(de)(de)(de)(de)差異，技(ji)術重(zhong)(zhong)復(fu)(fu)用于減少(shao)這(zhe)些(xie)結(jie)論的(de)(de)(de)(de)(de)變異性。
