在(zai)類人(ren)(ren)猿和(he)(he)(he)人(ren)(ren)類的(de)(de)(de)進化過(guo)程中(zhong)，松弛(chi)(chi)素基因(yin)(yin)經過(guo)復制，形成了(le)(le)兩(liang)個(ge)序列(lie)高度(du)相似松弛(chi)(chi)素基因(yin)(yin)，RLN1和(he)(he)(he)RLN2基因(yin)(yin)。高度(du)同源的(de)(de)(de)RLN1和(he)(he)(he)RLN2基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)同步表(biao)達(da)不利(li)于對(dui)(dui)其(qi)進行精(jing)準描(miao)述。澳(ao)大利(li)亞前(qian)列(lie)腺癌研(yan)究中(zhong)心Colleen Nelson教授研(yan)究團隊(dui)利(li)用(yong)(yong)Pacbio SMRT和(he)(he)(he)RNA-seq對(dui)(dui)LNCaP細(xi)胞(bao)系進行測(ce)序，來解析RLN1和(he)(he)(he)RLN2的(de)(de)(de)變異體的(de)(de)(de)表(biao)達(da)。文中(zhong)鑒定(ding)了(le)(le)一(yi)(yi)種新(xin)(xin)的(de)(de)(de)融(rong)合(he)轉錄本，其(qi)中(zhong)包含有RLN1和(he)(he)(he)RLN2基因(yin)(yin)，同時發(fa)現(xian)他們在(zai)正常組織和(he)(he)(he)前(qian)列(lie)腺癌組織中(zhong)都有表(biao)達(da)。融(rong)合(he)基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)鑒定(ding)提(ti)供了(le)(le)用(yong)(yong)以確定(ding)RLN1-RLN2融(rong)合(he)基因(yin)(yin)和(he)(he)(he)RLN1的(de)(de)(de)單(dan)拷(kao)貝區域的(de)(de)(de)信息。RLN1-RLN2融(rong)合(he)基因(yin)(yin)和(he)(he)(he)RLN1在(zai)LNCaP細(xi)胞(bao)中(zhong)共(gong)表(biao)達(da)，但是(shi)這兩(liang)個(ge)基因(yin)(yin)產(chan)物(wu)被雄激素負調(diao)控。這個(ge)發(fa)現(xian)對(dui)(dui)松弛(chi)(chi)素領域的(de)(de)(de)研(yan)究進行了(le)(le)更新(xin)(xin)，也(ye)激勵對(dui)(dui)RLN1和(he)(he)(he)RLN2在(zai)PCa 細(xi)胞(bao)系中(zhong)作用(yong)(yong)的(de)(de)(de)進一(yi)(yi)步研(yan)究。

結果

1、在(zai)PCa細胞系中鑒定新的RLN1-RLN2融合基因

將(jiang)環(huan)狀一致(zhi)性序列（CCSs）比(bi)對(dui)(dui)到(dao)RLN1-RLN2位點，發(fa)現CCSs能比(bi)對(dui)(dui)到(dao)已注(zhu)釋的RLN1基因(yin)，卻不(bu)能比(bi)對(dui)(dui)到(dao)已注(zhu)釋的RLN2基因(yin)。兩個較長的RLN2轉錄本的變(bian)異體和RLN1基因(yin)融(rong)合，形成了兩個融(rong)合基因(yin)RLN1-RLN2-1和RLN1-RLN2-2（圖1）。

圖1 利用SMRT測序識別LNCaP細(xi)胞中的(de)RLN1-RLN2融合基因(yin)

2、新(xin)RLN1-RLN2融合基因有(you)可選擇的ORF區域

新(xin)RLN1-RLN2融(rong)(rong)合基(ji)因(yin)包含(han)RLN1和(he)RLN2的(de)(de)(de)部分(fen)核(he)苷酸序列，并獲得(de)了基(ji)因(yin)間(jian)區(qu)的(de)(de)(de)新(xin)外顯(xian)子。較(jiao)(jiao)短的(de)(de)(de)RLN1-RLN2-1融(rong)(rong)合基(ji)因(yin)轉錄為RLN2肽(tai)，不考慮對其做深入研究。較(jiao)(jiao)長的(de)(de)(de)RLN1-RLN2-2融(rong)(rong)合基(ji)因(yin)預測是(shi)(shi)(shi)一個(ge)新(xin)RLN2異構(gou)體，這(zhe)個(ge)融(rong)(rong)合基(ji)因(yin)包含(han)有可(ke)選擇的(de)(de)(de)起(qi)始密碼子和(he)新(xin)的(de)(de)(de)外顯(xian)子（圖2）。新(xin)的(de)(de)(de)RLN2異構(gou)體包含(han)有完整的(de)(de)(de)RLN2的(de)(de)(de)功能域（B-chain，C-肽(tai)和(he)A-chain），但是(shi)(shi)(shi)丟失(shi)了整個(ge)的(de)(de)(de)信號(hao)序列，這(zhe)對于內質網-高爾基(ji)體途徑中的(de)(de)(de)分(fen)泌過程是(shi)(shi)(shi)必要的(de)(de)(de)。

圖2 RLN1-RLN2-2融合編碼一個假定的(de)沒有信號肽(tai)的(de)RLN2異(yi)構體。

3、鑒(jian)定RLN1-RLN2融合基因和RLN1的單拷貝(bei)區域

RLN1-RLN2-2融(rong)合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)和已(yi)注釋的(de)(de)(de)RLN1和RLN2基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)有(you)(you)明顯(xian)的(de)(de)(de)重疊區。利用(yong)(yong)BLAT工具和USCS基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)組瀏覽器比對新融(rong)合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，在RLN1-RLN2-2單拷貝(bei)區域設(she)計qPCR引(yin)物(wu)(wu)。設(she)計RLN1-RLN2-2融(rong)合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)特異(yi)(yi)性正向引(yin)物(wu)(wu)，需跨越融(rong)合(he)的(de)(de)(de)新外(wai)顯(xian)子(zi)和下游(you)的(de)(de)(de)融(rong)合(he)外(wai)顯(xian)子(zi)的(de)(de)(de)結合(he)位(wei)點。在RLN2和RLN1-RLN2-2融(rong)合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)共有(you)(you)區域設(she)計反向引(yin)物(wu)(wu)（圖3A）。同理(li)設(she)計RLN1的(de)(de)(de)qPCR引(yin)物(wu)(wu)。為了檢測引(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)特異(yi)(yi)性，用(yong)(yong)多四環素(su)誘導(dao)的(de)(de)(de)慢病毒載(zai)體(ti)轉(zhuan)染LNCaP細胞系(xi)，其編碼(ma)以(yi)(yi)注釋的(de)(de)(de)RLN2為靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)shRNA（shRLN2）。對照(zhao)是(shi)編碼(ma)非靶基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)shRNA（shNT）LNCaP細胞系(xi)。多四環素(su)的(de)(de)(de)處(chu)理(li)，對shNT細胞系(xi)中RLN1-RLN2-2融(rong)合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)表(biao)達沒有(you)(you)影響，但是(shi)在shRLN2細胞系(xi)中引(yin)起RLN1-RLN2-2融(rong)合(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)顯(xian)著減(jian)(jian)少（圖3B）。另外(wai)，多四環素(su)處(chu)理(li)減(jian)(jian)少了RLN1的(de)(de)(de)表(biao)達，但是(shi)在shNT和shRLN1細胞系(xi)之(zhi)間沒有(you)(you)差(cha)異(yi)(yi)，可以(yi)(yi)證明RLN1引(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)特異(yi)(yi)性（圖3C）。

圖3 鑒定識(shi)別RLN1-RLN2-2融合和RLN1的(de)單拷貝序列。

4、RLN1在PCa細胞系(xi)中表(biao)達(da)不(bu)具代表(biao)性

RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)和RLN1在(zai)轉錄本的同(tong)一(yi)(yi)鏈上(shang)有重疊區（圖(tu)1）。預測RLN1和RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)的表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)有關聯。首(shou)先檢(jian)測RLN1在(zai)3個正(zheng)(zheng)常(chang)組(zu)織(zhi)和7個PCa細(xi)胞(bao)系(xi)中(zhong)的表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)量。發(fa)現(xian)RLN1只在(zai)LNCaP細(xi)胞(bao)系(xi)中(zhong)大量表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)，但是(shi)在(zai)其(qi)他PCa細(xi)胞(bao)中(zhong)，表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)差異減少了80倍（圖(tu)4A）。同(tong)時發(fa)現(xian)，RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)在(zai)LNCaP細(xi)胞(bao)系(xi)中(zhong)高表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)，在(zai)其(qi)他PCa細(xi)胞(bao)系(xi)中(zhong)是(shi)低表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)（圖(tu)4B）。利用 GeneAtlas芯片數(shu)(shu)據分析進(jin)一(yi)(yi)步發(fa)現(xian)前例腺(xian)組(zu)織(zhi)中(zhong)RLN1特異性(xing)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)（圖(tu)4C）。另外(wai)，使(shi)用TCGA公共的RNA-seq數(shu)(shu)據，研究正(zheng)(zheng)常(chang)組(zu)織(zhi)和PCa組(zu)織(zhi)樣(yang)本以(yi)確認RLN1的表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)是(shi)否受正(zheng)(zheng)常(chang)前列腺(xian)組(zu)織(zhi)的限制(zhi)，發(fa)現(xian)正(zheng)(zheng)常(chang)組(zu)織(zhi)和PCa組(zu)織(zhi)高表(biao)(biao)達(da)(da)(da)(da)RLN1（圖(tu)4D）。

圖4 RLN1和(he)RLN1-RLN2-2融合(he)的共表(biao)(biao)達(da)及PCa細胞系中(zhong)RLN1表(biao)(biao)達(da)的不具(ju)代表(biao)(biao)性(xing)

5、RLN1-RLN2融合基因和(he)RLN1受雄激素調控

用胎(tai)牛血清(qing)（CSS）代替雄(xiong)激(ji)(ji)素培養LNCaP細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)10天(tian)，發(fa)現缺少雄(xiong)激(ji)(ji)素導(dao)(dao)致(zhi)RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)水平(ping)保(bao)持穩定(ding)增(zeng)(zeng)長（圖5A）。在缺少雄(xiong)激(ji)(ji)素的(de)(de)(de)(de)(de)情況下，RLN1的(de)(de)(de)(de)(de)水平(ping)也比較高，但是和(he)RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)相(xiang)比，這(zhe)種增(zeng)(zeng)長是微量的(de)(de)(de)(de)(de)。 為了(le)驗(yan)證(zheng)(zheng)RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)(zeng)加是雄(xiong)激(ji)(ji)素導(dao)(dao)致(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)，設(she)計(ji)了(le)相(xiang)似(si)的(de)(de)(de)(de)(de)實驗(yan)。將LNCaP細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)先(xian)在CSS中培養2天(tian)，然后用雄(xiong)激(ji)(ji)素處(chu)理(li)2天(tian)。處(chu)理(li)后的(de)(de)(de)(de)(de)LNCaP細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)中限制(zhi)(zhi)了(le)RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)表達(da)（圖5B）。雄(xiong)激(ji)(ji)素處(chu)理(li)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)和(he)對照相(xiang)比，雄(xiong)激(ji)(ji)素抑(yi)制(zhi)(zhi)作(zuo)用導(dao)(dao)致(zhi)了(le)RLN1-RLN2-2融合基(ji)(ji)因(yin)水平(ping)降低了(le)60-75%。和(he)RLN1-RLN2-2基(ji)(ji)因(yin)相(xiang)反(fan)，雄(xiong)激(ji)(ji)素的(de)(de)(de)(de)(de)處(chu)理(li)導(dao)(dao)致(zhi)RLN1表達(da)上調(diao)，表明(ming)雄(xiong)激(ji)(ji)素對基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)逆(ni)調(diao)控作(zuo)用（圖5C）。 為了(le)確認RLN1-RLN2-2和(he)RLN1與雄(xiong)激(ji)(ji)素的(de)(de)(de)(de)(de)逆(ni)調(diao)控作(zuo)用是由于(yu)雄(xiong)激(ji)(ji)素的(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)號(hao)傳(chuan)導(dao)(dao)作(zuo)用，特定(ding)地(di)使用多(duo)四(si)環素抑(yi)制(zhi)(zhi)AR，誘(you)(you)導(dao)(dao)shRNA敲(qiao)除（shAR）。在多(duo)環素誘(you)(you)導(dao)(dao)和(he)非誘(you)(you)導(dao)(dao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)中，對照細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)（shNT）DHT處(chu)理(li)抑(yi)制(zhi)(zhi)RLN1-RLN2-2融合（圖5D）。抑(yi)制(zhi)(zhi)作(zuo)用在非誘(you)(you)導(dao)(dao)shAR細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)中很明(ming)顯，但是多(duo)環素誘(you)(you)導(dao)(dao)AR敲(qiao)除改善了(le)這(zhe)種抑(yi)制(zhi)(zhi)作(zuo)用，證(zheng)(zheng)明(ming)雄(xiong)性激(ji)(ji)素信(xin)號(hao)傳(chuan)導(dao)(dao)下調(diao)RLN1-RLN2-2的(de)(de)(de)(de)(de)水平(ping)（圖5D）。和(he)RLN1-RLN2-2相(xiang)反(fan)，RLN1的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)在DHT處(chu)理(li)的(de)(de)(de)(de)(de)對照細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)中增(zeng)(zeng)加，但是這(zhe)種增(zeng)(zeng)加是受AR敲(qiao)除的(de)(de)(de)(de)(de)抑(yi)制(zhi)(zhi)（圖5E）。

圖5 RLN1-RLN2-2和RLN1受(shou)雄激素的負調控(kong)作用。

總結

文章目(mu)的(de)(de)是通過SMRT平臺對(dui)PCa LNCaP細(xi)胞(bao)系中全長RNA轉(zhuan)錄本進行(xing)測序，用以詳細(xi)解析RLN1，RLN2及它(ta)們(men)(men)的(de)(de)轉(zhuan)錄本變(bian)異體(ti)(ti)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)，鑒定RLN1和(he)RLN2的(de)(de)單拷貝序列，進而對(dui)它(ta)們(men)(men)進行(xing)更精(jing)準的(de)(de)描述。研究發現了(le)一種新的(de)(de)高表(biao)(biao)達(da)(da)的(de)(de)融(rong)合基因，包含有RLN1和(he)RLN2基因，推測編碼一個RLN2異構體(ti)(ti)，導致信號序列區域被改變(bian)，可能會(hui)改變(bian)細(xi)胞(bao)分泌方式(shi)。

參考文獻

Tevz G, McGrath S, Demeter R, et al. Identification of a novel fusion transcript between human relaxin-1 (RLN1) and human relaxin-2 (RLN2) in prostate cancer[J]. Molecular and cellular endocrinology, 2016, 420: 159-168.