2020-11-18
不少初(chu)次接觸轉錄組測序的(de)小伙(huo)伴，在拿(na)(na)到一份分(fen)析結果，并且興致沖(chong)沖(chong)地(di)打開差異表(biao)達分(fen)析的(de)表(biao)格(ge)后，卻被(bei)一連串(chuan)陌(mo)生的(de)名詞澆滅了科研的(de)熱情：foldchange是(shi)(shi)(shi)什(shen)么？為什(shen)么還有個log2foldchange？Pvalue我(wo)認識，那padj又是(shi)(shi)(shi)什(shen)么？重要的(de)是(shi)(shi)(shi)，這(zhe)個basemean到底該怎么理解(jie)？報告里說：basemean是(shi)(shi)(shi)DESeq軟(ruan)件對一個組內所有生物學重復的(de)基(ji)因表(biao)達量(liang)做“均一化”結果，可(ke)是(shi)(shi)(shi)我(wo)拿(na)(na)三(san)個重復的(de)fpkm算了平均數(shu)也對不上啊(a)？
莫慌！我們這就用大家都耳熟能詳的老朋友——Excel，來演示一下DESeq軟件對basemean的計算過程，詳細大家在看完這篇軟文之后會對basemean有一個清晰的認知。
（溫馨提示(shi)：文末有(you)“太長(chang)不看總結(jie)版”）
假設我們獲得了一張基因表達量表格(ge)，該表格(ge)中共有A1-A3，B1-B3共6個樣品，1-11編號的11個基因，基因表達量以read count值表示(shi)：
1、、對所有read count值取(qu)對數，0值仍記為(wei)0：
2、計(ji)算每個基因在(zai)6個樣(yang)品中(zhong)的表達量均值（橫向計(ji)算）
3、用(yong)每個基因的(de)(de)表達量減去(qu)對應的(de)(de)均值，即2-7列的(de)(de)數據(ju)依次減去(qu)第8列的(de)(de)數據(ju)
4、按樣品取中位數
5、因為計算(suan)的(de)第一步(bu)取(qu)了(le)對數，所以現在將中位數利用指(zhi)數函數轉(zhuan)換(huan)回(hui)去，記為sizefactor
6、回到原始的(de)read count表(biao)格，用(yong)每一個數(shu)值除(chu)以(yi)對應樣(yang)品的(de)sizefactor，得(de)到均一化的(de)表(biao)達量
7、按照分(fen)組方(fang)式(shi)計算平均(jun)數，記(ji)為basemean（這里為了展示方(fang)便保留了兩位(wei)小(xiao)數）
自此我(wo)們已經得(de)出了A組與B組每個基(ji)因的(de)basemean，接下來通過兩個basemean相(xiang)除，我(wo)們就可以得(de)到差(cha)異(yi)倍數foldchange，再通過負二(er)項分布檢驗，我(wo)們就得(de)到了代表(biao)顯著性的(de)P值和padj值。這樣一張差(cha)異(yi)表(biao)達分析表(biao)是不是就初見雛形了呢(ni)！
“太長不(bu)看(kan)總結版”
從DESeq的basemean的計算原理我們可以知道：
NO.1basemean不(bu)是通(tong)過fpkm計算(suan)的(de)(de)，也不(bu)是直(zhi)接求(qiu)平均數(shu)算(suan)的(de)(de)，是先(xian)用(yong)read count除(chu)以sizefactor進行均一化，再用(yong)均一化之后的(de)(de)read count按分組(zu)方式計算(suan)平均數(shu)。所以我們說basemean是基因表達量的(de)(de)“均一化”結果，而不(bu)能直(zhi)接說是fpkm的(de)(de)平均數(shu)。
NO.2“牽一(yi)(yi)發(fa)而(er)動全(quan)身”：計算(suan)sizefactor時先通過橫向(xiang)（樣品）計算(suan)Δ值，再通過縱向(xiang)（基(ji)因(yin)）找(zhao)出Δ值的(de)中位數，因(yin)此一(yi)(yi)旦(dan)改變任何一(yi)(yi)個樣品或(huo)一(yi)(yi)個基(ji)因(yin)，所(suo)有的(de)sizefactor都會(hui)跟(gen)著發(fa)生變化(hua)，也就(jiu)(jiu)會(hui)導致(zhi)basemean變化(hua)。理解了(le)這一(yi)(yi)點，我們就(jiu)(jiu)可(ke)以解決這樣的(de)問題了(le)：“A VS C和A VS B兩(liang)(liang)個DESeq表，A組(zu)沒有變啊，為(wei)什(shen)么兩(liang)(liang)個表里同一(yi)(yi)個基(ji)因(yin)的(de)basemeanA是(shi)不(bu)同的(de)？”
鄭重申明(ming)：本文對于(yu)basemean的計算僅用于(yu)展示(shi)軟(ruan)(ruan)件(jian)分析(xi)原理，實(shi)際(ji)結果請(qing)以派森諾提供的差異(yi)分析(xi)結果為準。
