2020-11-19
關于NGS文(wen)庫質檢的事，上次我們聊(liao)了文(wen)庫片段方面 ，今(jin)天我們來聊聊文庫濃度方面。
對(dui)于illumina 測序平臺，準確的(de)文庫(ku)濃度是獲得高(gao)質量測序數據的(de)前提，因為：
1、如果上機lane的(de)濃度過低，則導致數(shu)據產出少，將(jiang)不能獲得足(zu)夠的(de)測(ce)序(xu)數(shu)據，需要(yao)補測(ce)以(yi)達(da)到需要(yao)的(de)數(shu)據量(liang)，增加了測(ce)序(xu)費用和測(ce)序(xu)周(zhou)期(qi)。
2、如果上機lane的濃度過高，將(jiang)產生(sheng)低(di)質量的測(ce)序數(shu)據，甚(shen)至會(hui)導致(zhi)測(ce)序失敗。
此外，目(mu)前主流(liu)的(de)illumina測序(xu)(xu)儀Novaseq 6000每張(zhang)S4測序(xu)(xu)芯(xin)片(pian)可以產(chan)出至(zhi)少3.2T的(de)數據(ju)，而單個(ge)樣(yang)品需要的(de)數據(ju)量遠(yuan)遠(yuan)小于一張(zhang)芯(xin)片(pian)的(de)產(chan)出，因此，通常將多個(ge)樣(yang)品混(hun)合(he)到(dao)一起(qi)進行(xing)測序(xu)(xu)，后續(xu)再根(gen)據(ju)每個(ge)樣(yang)品建庫時(shi)用的(de)index標簽來區分(fen)；混(hun)合(he)到(dao)一起(qi)的(de)各(ge)個(ge)樣(yang)品的(de)產(chan)出，理(li)(li)論(lun)上(shang)(shang)與其物質的(de)量占比(bi)成(cheng)正(zheng)比(bi)，舉(ju)個(ge)例子：假設只有(you)A和B兩個(ge)樣(yang)品，物質的(de)量各(ge)占50%，則(ze)產(chan)出100G數據(ju)時(shi)，理(li)(li)論(lun)上(shang)(shang)A有(you)50G，B有(you)50G；當A占90%，B占10%，產(chan)出100G數據(ju)時(shi)，理(li)(li)論(lun)上(shang)(shang)A為90G，B為10G。
由此可(ke)看出，準確可(ke)靠的(de)文(wen)庫濃(nong)度一(yi)方面(mian)(mian)決(jue)定了(le)一(yi)張測序芯片的(de)產出，另一(yi)方面(mian)(mian)決(jue)定了(le)混合文(wen)庫中各個子文(wen)庫的(de)產出。明白了(le)文(wen)庫濃(nong)度檢測的(de)重要性，下面(mian)(mian)我們來聊聊幾種常見的(de)文(wen)庫濃(nong)度檢測方法。
一、紫外吸收法
紫外(wai)吸(xi)收(shou)法的(de)原理是：核(he)苷、核(he)苷酸(suan)、核(he)酸(suan)的(de)組成成分中都有(you)嘌呤、嘧啶堿基，這些堿基都具有(you)共軛雙鍵，在紫外(wai)光區(qu)的(de)250-280nm處有(you)強烈的(de)光吸(xi)收(shou)作用，最大吸(xi)收(shou)值(zhi)在260nm左右(you)，因此可(ke)以利用核(he)酸(suan)的(de)紫外(wai)吸(xi)收(shou)性進行濃度定量。
采用紫外吸收法進(jin)行濃度(du)定量的(de)常見儀器有NanoDrop分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)（如圖(tu)1），NanoDrop分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)操作簡便，迅速，但(dan)缺點是無(wu)法區分(fen)DNA、RNA、降解核酸(suan)、游離核苷酸(suan)及(ji)其它雜質(zhi)(zhi)，此外，待測樣品(pin)的(de)濃度(du)小于100ng/ul時(shi)，檢(jian)測結果(guo)的(de)變異度(du)增大，可信(xin)度(du)不(bu)高，因此，該儀器更推薦用于檢(jian)測提取后(hou)的(de)DNA或(huo)者RNA的(de)質(zhi)(zhi)量，通過比(bi)較(jiao)A260/A280和(he)A260/A230的(de)比(bi)值判斷(duan)提取后(hou)核酸(suan)的(de)純(chun)度(du)。純(chun)RNA的(de)A260/A280 ≥2.0，DNA的(de)A260/A280 ≥1.8，當樣品(pin)中雜質(zhi)(zhi)含量較(jiao)高時(shi)，比(bi)值下降，RNA和(he)DNA的(de)比(bi)值分(fen)別低于2.0和(he)1.8時(shi)，建議純(chun)化除去雜質(zhi)(zhi)。
圖(tu)1
二、熒光染料法(fa)
熒(ying)光(guang)染(ran)(ran)料(liao)法的(de)原(yuan)理是(shi)：熒(ying)光(guang)染(ran)(ran)料(liao)與特異性的(de)靶分子(zi)（DNA、RNA或者蛋白質）結(jie)合后(hou)發(fa)出的(de)熒(ying)光(guang)強(qiang)度(du)比未(wei)結(jie)合前(qian)的(de)熒(ying)光(guang)強(qiang)度(du)高許多，可以減少游離熒(ying)光(guang)對背景信號的(de)干擾，且(qie)所產生的(de)熒(ying)光(guang)強(qiang)度(du)與特異性靶分子(zi)的(de)濃(nong)度(du)成(cheng)正比，這(zhe)樣即使(shi)在雜質污染(ran)(ran)條件下，也(ye)不會受(shou)到干擾，從而得(de)到可靠的(de)濃(nong)度(du)。
熒光染料法常用(yong)的儀器有Qubit（如(ru)圖(tu)2），通(tong)過使用(yong)不同的熒光染料，可以特(te)異性(xing)地檢(jian)測雙(shuang)(shuang)鏈DNA、RNA或蛋白質(zhi)，檢(jian)測靈敏度高且重復性(xing)好，雙(shuang)(shuang)鏈DNA濃度低至0.5ng/ul也(ye)只(zhi)需(xu)1ul即可完成檢(jian)測。
圖2
三、實時熒光定量PCR法（qPCR法）
實時(shi)熒光(guang)定量PCR技術（qPCR法）是(shi)熒光(guang)檢測技術和PCR技術的(de)結合，在(zai)PCR反應體(ti)系中加(jia)入熒光(guang)基團，通(tong)(tong)過實時(shi)監(jian)測整(zheng)個PCR過程中熒光(guang)信號的(de)變化(hua)情(qing)況，反映濃度的(de)變化(hua)情(qing)況，最后通(tong)(tong)過已知濃度的(de)標準(zhun)曲線計算未知樣品(pin)的(de)濃度。
qPCR儀器主流(liu)的品牌有(you)Thermofisher、ROCHE、BIO-RAD。qPCR法涉及到PCR擴增過程，在(zai)PCR擴增時特異性的引物僅會定量兩端接(jie)頭連接(jie)完(wan)整的文庫(ku)(ku)（即可(ke)(ke)測序的文庫(ku)(ku)），可(ke)(ke)排(pai)除單端或雙端都不連接(jie)接(jie)頭的不可(ke)(ke)測序文庫(ku)(ku)的干擾，是目前業內進行文庫(ku)(ku)定量推薦的方法。
最(zui)(zui)后，小(xiao)編再分享(xiang)一些個(ge)人的(de)經驗，由于(yu)熒光染料(liao)法(fa)(fa)無法(fa)(fa)區分單端或(huo)雙(shuang)端都(dou)不連(lian)接接頭(tou)的(de)不可測序文(wen)(wen)庫(ku)(ku)，得到的(de)濃(nong)度(du)可能偏(pian)高，因(yin)此qPCR法(fa)(fa)成為(wei)了文(wen)(wen)庫(ku)(ku)濃(nong)度(du)定量最(zui)(zui)推薦的(de)方(fang)法(fa)(fa)，因(yin)為(wei)該方(fang)法(fa)(fa)只會檢測兩端接頭(tou)連(lian)接完整的(de)文(wen)(wen)庫(ku)(ku)，但是(shi)qPCR法(fa)(fa)也有其局限性(xing)，如果文(wen)(wen)庫(ku)(ku)中有抑制PCR擴增的(de)雜質存在，qPCR法(fa)(fa)定量得到的(de)濃(nong)度(du)會偏(pian)低。因(yin)此，建議結(jie)(jie)合兩種(zhong)方(fang)法(fa)(fa)的(de)結(jie)(jie)果進行判斷，選擇最(zui)(zui)準(zhun)確(que)的(de)文(wen)(wen)庫(ku)(ku)濃(nong)度(du)。
相信不少老師對于濃(nong)度檢測也存在一些疑惑：為什么各家公司(si)檢測的結果差異(yi)如此巨大？下面就這個(ge)情況小編來(lai)分享(xiang)一些個(ge)人的想法(fa)。
濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)檢測(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果(guo)受儀(yi)器狀態(tai)、人(ren)員(yuan)(yuan)操作(zuo)(zuo)、試劑(ji)耗材等因(yin)素(su)(su)影響，其中儀(yi)器狀態(tai)因(yin)素(su)(su)不(bu)需(xu)過多考(kao)慮(lv)，重點考(kao)慮(lv)的(de)(de)(de)(de)(de)因(yin)素(su)(su)是(shi)人(ren)員(yuan)(yuan)操作(zuo)(zuo)和試劑(ji)耗材。檢測(ce)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)移液(ye)體積都非常(chang)少，約1-5ul，因(yin)此(ci)非常(chang)考(kao)驗操作(zuo)(zuo)人(ren)員(yuan)(yuan)使用移液(ye)器的(de)(de)(de)(de)(de)水平，結(jie)果(guo)偏離預期較(jiao)大(da)時，首(shou)先應安排重新檢測(ce)；試劑(ji)耗材也(ye)是(shi)一個重要的(de)(de)(de)(de)(de)影響因(yin)素(su)(su)，下面我們以qPCR實驗的(de)(de)(de)(de)(de)簡化模(mo)型作(zuo)(zuo)為例(li)子說(shuo)明，qPCR實驗未知樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)是(shi)通過已知濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)計算得出(chu)，不(bu)同廠商標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)實際(ji)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)與宣稱的(de)(de)(de)(de)(de)有差異，以圖3作(zuo)(zuo)個簡單的(de)(de)(de)(de)(de)說(shuo)明，假(jia)設B廠商標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)B的(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)是(shi)真實的(de)(de)(de)(de)(de)10nM，此(ci)時待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)與標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)B對(dui)比(bi)，可得出(chu)待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為5nM；但(dan)如果(guo)我們將待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)與同樣(yang)宣稱濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)是(shi)10nM但(dan)實際(ji)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)是(shi)5nM的(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)A對(dui)比(bi)，我們就會(hui)得出(chu)待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)為10nM，這(zhe)樣(yang)一看，只是(shi)標(biao)準(zhun)(zhun)品(pin)不(bu)同，結(jie)果(guo)卻相差了2倍。
圖(tu)3
最后，我們用(yong)一個表格來總(zong)結3種濃度檢測方式(shi)吧。
