2020-11-23
導語
單(dan)細(xi)胞測序=高分文(wen)章？在一(yi)兩年前，大概確實如(ru)此(ci)。然(ran)而到了今天，研究者對(dui)此(ci)已經越(yue)來越(yue)心存懷疑。從一(yi)個具體的(de)生物學問題出發，準備好精巧的(de)實驗設(she)計，加上個性化的(de)分析方案，最終得出推陳出新的(de)結論，已然(ran)成為單(dan)細(xi)胞測序的(de)新方向。
今天，小編以一篇利用單細胞測序技術，解析附肢發育的轉錄圖譜的文章為例，帶領大家思考，我們是否能比作者做的更多，做的更好？
脊椎動物的附肢是一(yi)個及(ji)其(qi)復(fu)雜的器官(guan)，每(mei)一(yi)塊骨(gu)(gu)(gu)和(he)肌(ji)(ji)(ji)肉的位(wei)置都被(bei)精密地組(zu)織(zhi)(zhi)在(zai)一(yi)起(qi)。附肢發(fa)(fa)育的機制(zhi)研究是一(yi)個解析(xi)(xi)脊椎動物的器官(guan)發(fa)(fa)生(sheng)分子機制(zhi)研究的重要范例。作(zuo)者取了(le)(le)胚胎發(fa)(fa)育的三個時(shi)(shi)期(qi)，HH25，HH29，HH31的三個樣(yang)本進(jin)行單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)測序分析(xi)(xi)。結果顯示(shi)，在(zai)HH25時(shi)(shi)期(qi)，鑒定到(dao)間(jian)充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、骨(gu)(gu)(gu)骼(ge)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)以(yi)(yi)及(ji)皮(pi)(pi)膚(fu)、肌(ji)(ji)(ji)肉、血(xue)液細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)；HH29時(shi)(shi)期(qi)，鑒定到(dao)間(jian)充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、遠(yuan)端(duan)間(jian)充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、骨(gu)(gu)(gu)骼(ge)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)以(yi)(yi)及(ji)指間(jian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、非(fei)骨(gu)(gu)(gu)骼(ge)連接組(zu)織(zhi)(zhi)、皮(pi)(pi)膚(fu)、肌(ji)(ji)(ji)肉、血(xue)液、血(xue)管內皮(pi)(pi)、血(xue)管平滑(hua)肌(ji)(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)；HH31時(shi)(shi)期(qi)因為(wei)選取的組(zu)織(zhi)(zhi)區域較小，因此(ci)僅鑒定到(dao)間(jian)充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、遠(yuan)端(duan)間(jian)充(chong)質(zhi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、骨(gu)(gu)(gu)骼(ge)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)以(yi)(yi)及(ji)指間(jian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)皮(pi)(pi)膚(fu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。針對不同(tong)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類群，分別分析(xi)(xi)了(le)(le)其(qi)特(te)異激活的信號(hao)通(tong)路以(yi)(yi)及(ji)高表達的marker基因，進(jin)一(yi)步(bu)驗證了(le)(le)附肢發(fa)(fa)育過(guo)程中不同(tong)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類群。
針對17628個(ge)細(xi)胞(bao)的單細(xi)胞(bao)測(ce)序，作者獲得了17828個(ge)轉錄(lu)組。利用這些轉錄(lu)組數(shu)據，作者進行了WGCNA分析，通過篩選各個(ge)共(gong)表(biao)達基(ji)因(yin)(yin)，獲取附肢發(fa)育過程關(guan)鍵的候選基(ji)因(yin)(yin)列表(biao)。總體而言，WGCNA的共(gong)表(biao)達genemodule與(yu)不同sub-cluster密切相關(guan)。比如，HH29的sub-cluster5主(zhu)(zhu)要富集(ji)了module Green，sub-cluster16主(zhu)(zhu)要富集(ji)了module Pink。從功能角度看，module Green/sub-cluster5主(zhu)(zhu)要與(yu)有(you)絲分裂(lie)有(you)關(guan)，module Pink/sub-cluster16主(zhu)(zhu)要與(yu)G2/M transition有(you)關(guan)，這與(yu)t-SNE分布圖上(shang)兩個(ge)sub-cluster的空間分布接(jie)近是吻合的。以(yi)上(shang)結果，非常合理，但是讀起來，似乎少了一點創(chuang)新性。
作者將單細胞(bao)測(ce)序(xu)數據與一(yi)(yi)個已報道的(de)(de)(de)(de)(de)根(gen)據不(bu)同腳趾(zhi)(zhi)以(yi)及趾(zhi)(zhi)間組織(zhi)分(fen)別(bie)取樣(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)bulk RNA測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果進行聯合分(fen)析(xi)。在根(gen)據bulk RNA測(ce)序(xu)結(jie)果篩(shai)選了(le)(le)54個第(di)(di)三趾(zhi)(zhi)和第(di)(di)四(si)趾(zhi)(zhi)特異表達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因里，作者關注了(le)(le)7個在第(di)(di)四(si)趾(zhi)(zhi)高(gao)表達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因，這7個基(ji)因在單細胞(bao)測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果里，3個是(shi)module midnightblue的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因，4個是(shi)sub-cluster2的(de)(de)(de)(de)(de)marker基(ji)因。據此(ci)，作者推斷，sub-cluster2是(shi)第(di)(di)四(si)趾(zhi)(zhi)發育的(de)(de)(de)(de)(de)祖細胞(bao)。針對其它的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)些module，作者同樣(yang)地分(fen)析(xi)了(le)(le)一(yi)(yi)遍，小編(bian)在此(ci)不(bu)做贅(zhui)述(shu)。
作者針對(dui)不同的(de)基因進行了深入分(fen)析，但是忽略了細(xi)胞(bao)間的(de)關系(xi)。單細(xi)胞(bao)測序在發育生(sheng)物學中(zhong)的(de)應(ying)用，很(hen)重(zhong)要(yao)的(de)一個工具是擬時序分(fen)析。擬時序分(fen)析呈現(xian)一系(xi)列細(xi)胞(bao)的(de)擬時間軸上的(de)分(fen)布，分(fen)析不同細(xi)胞(bao)之間的(de)演化(hua)狀態，并能(neng)(neng)篩選去命運轉換過(guo)程中(zhong)特異(yi)表達的(de)基因，這些(xie)基因可能(neng)(neng)就是決定細(xi)胞(bao)命運的(de)關鍵(jian)基因。
根據HH29的(de)t-SNE結果(guo)可見，趾(zhi)間組織主要由sub-cluster2、6、12三(san)個亞群構成(cheng)。這三(san)個亞群，可被(bei)挑(tiao)選(xuan)出來進行后(hou)續(xu)(xu)分析。根據bulk RNA測序(xu)(xu)的(de)結果(guo)，可以(yi)挑(tiao)選(xuan)出在(zai)第四趾(zhi)特異表達(da)的(de)基(ji)因(yin)(yin)，據此可篩選(xuan)這些(xie)表達(da)基(ji)因(yin)(yin)表達(da)的(de)sub-cluster。將依據不同方法篩選(xuan)的(de)sub-cluster進行擬時序(xu)(xu)分析，分析這些(xie)細(xi)胞的(de)演化(hua)狀態(tai)，并篩選(xuan)出處于中間狀態(tai)的(de)細(xi)胞，解析第四趾(zhi)的(de)發育軌跡。這些(xie)細(xi)胞里高(gao)表達(da)的(de)基(ji)因(yin)(yin)，則可以(yi)作為決定趾(zhi)的(de)發育的(de)關鍵候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)(yin)，進行后(hou)續(xu)(xu)研究。
此(ci)文的(de)(de)作者(zhe)非(fei)常幸運，之(zhi)前(qian)有(you)報道了他感興趣的(de)(de)第四趾的(de)(de)特定區域的(de)(de)bulk RNA測序的(de)(de)結果。在實際的(de)(de)研究(jiu)中，很多工(gong)(gong)作都(dou)沒有(you)可供參考的(de)(de)已發表結果。那么，我(wo)們(men)又該(gai)如何進行科學研究(jiu)工(gong)(gong)作呢？以這(zhe)個(ge)case為例，空間轉錄(lu)組測序是一個(ge)非(fei)常好的(de)(de)解決(jue)方案。
空(kong)間(jian)轉錄組(zu)測序的HE染(ran)色圖片上，可(ke)以輕而易舉地篩(shai)選感興趣(qu)空(kong)間(jian)對(dui)應的spot，并查閱在這些(xie)spot里特異表(biao)達(da)的基(ji)(ji)因。通過分析(xi)這些(xie)基(ji)(ji)因在單細(xi)胞測序結(jie)果里高(gao)表(biao)達(da)的cluster、，即(ji)可(ke)判斷在感興趣(qu)的區域，聚集了哪些(xie)細(xi)胞類(lei)型(xing)。以這些(xie)細(xi)胞類(lei)型(xing)作為研(yan)究切入點，分析(xi)相(xiang)(xiang)近的cluster之間(jian)的細(xi)胞演化關系，以及(ji)關鍵演化狀態(tai)中的特異表(biao)達(da)基(ji)(ji)因，可(ke)篩(shai)選到(dao)感興趣(qu)組(zu)織類(lei)型(xing)發(fa)育相(xiang)(xiang)關的關鍵基(ji)(ji)因，為后(hou)續研(yan)究奠定(ding)基(ji)(ji)礎(chu)。
總結來(lai)說，這(zhe)篇文章描述了(le)(le)發(fa)育過程中的(de)不同(tong)細胞(bao)類(lei)型，缺乏明確(que)的(de)生(sheng)物學問題。樣本的(de)設(she)置，無(wu)論是(shi)(shi)(shi)時間(jian)維度(du)還是(shi)(shi)(shi)生(sheng)物學重復維度(du)，都(dou)太少了(le)(le)。作(zuo)者獲得了(le)(le)17628個(ge)轉錄組，將這(zhe)些(xie)轉錄組進(jin)行了(le)(le)WGCNA的(de)分析(xi)，忽略了(le)(le)不同(tong)轉錄組即細胞(bao)之(zhi)間(jian)的(de)相關(guan)性；而細胞(bao)間(jian)的(de)相關(guan)性，恰是(shi)(shi)(shi)單細胞(bao)測序的(de)一個(ge)重要解析(xi)點(dian)。作(zuo)者雖然篩選了(le)(le)一些(xie)基(ji)因，但是(shi)(shi)(shi)對這(zhe)些(xie)基(ji)因的(de)功(gong)能，尚未進(jin)行嚴謹的(de)生(sheng)物學研(yan)究。
科(ke)學(xue)研究的重中之重，還是生(sheng)物學(xue)問題(ti)。如(ru)何(he)提出生(sheng)物學(xue)問題(ti)，如(ru)何(he)解決生(sheng)物學(xue)問題(ti)，還是科(ke)學(xue)研究的重點。派(pai)森(sen)諾推出多組學(xue)整合(he)方案(an)，結合(he)生(sheng)物學(xue)問題(ti)，個(ge)性化地結合(he)適合(he)的技術(shu)手段，為科(ke)學(xue)研究添磚加(jia)瓦。
