2020-12-14
單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)測序(xu)(xu)已(yi)然成為學術界的(de)(de)(de)新寵(chong)，將研(yan)究(jiu)深入(ru)到組(zu)織內部，解析組(zu)織的(de)(de)(de)異質(zhi)性，不(bu)斷刷新人們對生命科(ke)學研(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)認知。單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)測序(xu)(xu)通常需要新鮮樣(yang)本(ben)進行實驗，這給單(dan)(dan)細(xi)胞(bao)測序(xu)(xu)的(de)(de)(de)應用帶來了一定的(de)(de)(de)挑戰。不(bu)少老師保存了長時間積攢的(de)(de)(de)珍貴的(de)(de)(de)臨(lin)床樣(yang)本(ben)，如果能夠針對這些凍存樣(yang)本(ben)進行深入(ru)的(de)(de)(de)異質(zhi)性研(yan)究(jiu)，無疑具(ju)有重大意義。 小編將介紹一系列的(de)如何(he)利(li)用凍存樣(yang)(yang)本(ben)進行解析組織(zhi)異質性研(yan)究的(de)高(gao)分文(wen)章案(an)(an)例(li)，幫助研(yan)究者針對(dui)性地利(li)用樣(yang)(yang)本(ben)資(zi)源(yuan)進行個性化的(de)方案(an)(an)設(she)計。今天，小編就為大家(jia)介紹一篇關于單細胞核測序(xu)研(yan)究凍存樣(yang)(yang)本(ben)的(de)文(wen)章。 發表雜(za)志：Nature Medicine 影響因子：36.13 發(fa)表時間：2020年1月 關鍵詞：腦(nao)發育，阿(a)爾茲海(hai)默癥，TREM2，單細胞核(he)測序 阿爾(er)茨(ci)海默(mo)(mo)病（AD）是(shi)一(yi)種(zhong)起(qi)病隱匿的(de)進行(xing)性發(fa)(fa)展的(de)神經系統退行(xing)性疾(ji)病。隨(sui)著人口老齡化的(de)發(fa)(fa)展，AD患者數量急劇增(zeng)加(jia)。目前對(dui)于阿爾(er)茲海默(mo)(mo)癥的(de)研究(jiu)，已經深(shen)入到多組(zu)學水(shui)平(ping)。前期研究(jiu)發(fa)(fa)現小膠質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)在大(da)腦疾(ji)病中發(fa)(fa)揮重要功(gong)能，其(qi)主要通過細(xi)(xi)胞(bao)數目、細(xi)(xi)胞(bao)基因(yin)表達(da)譜等多水(shui)平(ping)發(fa)(fa)揮功(gong)能。因(yin)此，針對(dui)大(da)腦中的(de)小膠質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)，尤其(qi)是(shi)其(qi)基因(yin)表達(da)譜的(de)研究(jiu)，對(dui)于揭示AD發(fa)(fa)病機制具有(you)重要意義(yi)。 作者首先針對野生型(xing)小(xiao)鼠(shu)，AD小(xiao)鼠(shu)，Trem2敲除小(xiao)鼠(shu)，以及前兩(liang)者的(de)(de)雙突(tu)變(bian)小(xiao)鼠(shu)各三只，取大(da)(da)腦組織(zhi)進(jin)行單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)核測序，捕獲到73419個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)核進(jin)行細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)分群分析，共(gong)鑒(jian)定到10個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類群，5種細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型(xing)。非常值得注(zhu)意的(de)(de)是(shi)，AD小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)小(xiao)膠質(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)數量大(da)(da)大(da)(da)增加，并且星形膠質(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數量減少。因(yin)此，這兩(liang)類細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)首當其沖地(di)成為后續研究的(de)(de)重點關(guan)注(zhu)對象。此外，雙突(tu)變(bian)體的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數量，與Trem 2-/-突(tu)變(bian)體以及野生型(xing)的(de)(de)數量相近，掩(yan)蓋了(le)AD小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)異常表型(xing)，暗示AD產生依(yi)賴于TREM2。 為進(jin)一步(bu)(bu)研究機制，作者挑選差(cha)異最(zui)大(da)(da)的(de)(de)(de)小膠質細(xi)胞(bao)進(jin)一步(bu)(bu)分(fen)析(xi)(xi)。各基(ji)因(yin)型(xing)小鼠(shu)的(de)(de)(de)marker基(ji)因(yin)分(fen)析(xi)(xi)進(jin)一步(bu)(bu)支持Trem2參(can)(can)與AD產生(sheng)。此外，將小膠質細(xi)胞(bao)進(jin)一步(bu)(bu)分(fen)群，根(gen)據基(ji)因(yin)表達(da)譜分(fen)成4個sub-cluster。有趣的(de)(de)(de)是，AD小鼠(shu)中sub-cluster1的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)數量大(da)(da)大(da)(da)增加，而sub-cluter0的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)數量大(da)(da)大(da)(da)減少，說明這兩(liang)個sub-cluster可能與AD產生(sheng)具有更(geng)密切(qie)的(de)(de)(de)關系。分(fen)析(xi)(xi)這兩(liang)個sub-cluster的(de)(de)(de)marker基(ji)因(yin)，篩(shai)選到三(san)個基(ji)因(yin)，這三(san)個基(ji)因(yin)可能是參(can)(can)與AD形成的(de)(de)(de)關鍵基(ji)因(yin)。 此外，作者(zhe)對(dui)另外一種膠(jiao)質細(xi)(xi)胞(bao)，少突膠(jiao)質細(xi)(xi)胞(bao)及其祖(zu)細(xi)(xi)胞(bao)進行了(le)分析。少突膠(jiao)質細(xi)(xi)胞(bao)的細(xi)(xi)胞(bao)數量沒有(you)明顯差(cha)異(yi)，因(yin)此作者(zhe)關注(zhu)在(zai)AD小鼠的少突膠(jiao)質細(xi)(xi)胞(bao)及其祖(zu)細(xi)(xi)胞(bao)中特異(yi)高表達(da)的基因(yin)，關注(zhu)到了(le)C4b和Serpina3這兩個(ge)基因(yin)，并通過免疫熒光進行實(shi)驗(yan)(yan)驗(yan)(yan)證(zheng)。 隨后(hou)，作者對AD高風險病例10例，TREM2-CV 11例以及(ji)無AD病例11例的(de)腦背外(wai)側(ce)前(qian)額葉(xie)皮質區域，進行單(dan)細(xi)(xi)胞核測序，共捕獲到(dao)66311個細(xi)(xi)胞核。同樣地(di)，對單(dan)細(xi)(xi)胞核測序結果(guo)進行細(xi)(xi)胞分(fen)群(qun)、marker基(ji)因(yin)鑒定(ding)、差(cha)異表(biao)達基(ji)因(yin)分(fen)析及(ji)其(qi)免疫(yi)熒光驗(yan)證(zheng)以及(ji)針對小膠質細(xi)(xi)胞重新分(fen)群(qun)的(de)分(fen)析，比較AD小鼠模型和AD病人的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達差(cha)異。 作(zuo)(zuo)者(zhe)仍然是(shi)首先(xian)關(guan)注細(xi)(xi)胞(bao)數目(mu)，發現(xian)AD病(bing)人中星形膠(jiao)質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)數目(mu)減少。進一步(bu)地挑選(xuan)星形膠(jiao)質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)進行重新分群，marker基(ji)因鑒定等分析。針對細(xi)(xi)胞(bao)數目(mu)差異不顯著的(de)(de)少突(tu)膠(jiao)質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)，特異的(de)(de)差異表達(da)基(ji)因仍然是(shi)研究切入(ru)點。據此，作(zuo)(zuo)者(zhe)篩選(xuan)到了影(ying)響三(san)類膠(jiao)質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)關(guan)鍵基(ji)因，通過對這些基(ji)因的(de)(de)功能及所在信號(hao)通路的(de)(de)分析，解(jie)析AD的(de)(de)發病(bing)機制。 此外，作(zuo)者分(fen)析(xi)了大(da)樣本的(de)(de)bulk RNA-seq分(fen)析(xi)，篩選到(dao)與單細胞(bao)測序(xu)結(jie)果(guo)一(yi)致的(de)(de)基因。分(fen)析(xi)了大(da)樣本的(de)(de)不(bu)同TREM2突變類型的(de)(de)病例，比較兩(liang)者的(de)(de)基因表達譜，估算的(de)(de)特定細胞(bao)類群的(de)(de)數(shu)目和信號(hao)通路，分(fen)析(xi)不(bu)同類別突變類型影(ying)響不(bu)同AD進展的(de)(de)分(fen)子機(ji)制。 總結(jie)來說(shuo)，單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)核測序(xu)(xu)與單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)測序(xu)(xu)的(de)(de)分(fen)(fen)析方(fang)法、數據(ju)呈現方(fang)式以及(ji)能(neng)解決的(de)(de)生物學問題等多方(fang)面(mian)均沒(mei)有差(cha)別。當我們獲得海量(liang)的(de)(de)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)測序(xu)(xu)數據(ju)后(hou)，不妨可以試試像這(zhe)篇(pian)文章的(de)(de)思路，挑(tiao)選細(xi)(xi)(xi)胞(bao)數目存在差(cha)異的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，挑(tiao)選已經(jing)報道了參與某疾病(bing)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，關注這(zhe)些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)差(cha)異表達基因，揭示(shi)疾病(bing)發生機制。并通過(guo)大樣(yang)本(ben)的(de)(de)bulk RNAseq測序(xu)(xu)分(fen)(fen)析，有望獲得疾病(bing)類型、不同疾病(bing)進展(zhan)階段(duan)以及(ji)不同預后(hou)的(de)(de)診斷(duan)標記物，為未來的(de)(de)臨床診斷(duan)提供理論(lun)依(yi)據(ju)。
