2017-08-16
最新一期Clinical Cancer Research (IF: 9.619)上刊登了美國明尼蘇達大學研究團隊關于前列腺癌腫瘤標志物的最新研究成果，文章題為“Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance”。該研究團隊采用PacBio全長轉錄本測序（Iso-Seq）的方法對前列腺癌化療的抗性標志物——雄激素受體變異體（AR-V）的轉錄本結構特征進行深入分析。雄激素受體（Androgen receptor，AR）是正常前列腺細胞以及前列腺癌細胞中最主要的轉錄調節因子。已有研究表明，雄激素受體AR-V7是不依賴配體的轉錄因子，會促進前列腺癌對AR靶向治療產生抗性，臨床上已將AR-V7作為一種生物標志物，并建立了監測和抑制AR-V7表達的方法。由于受二代測序讀長的限制，無法對完整的AR及AR轉錄本異構體進行準確定量，因此研究人員無法搞清楚是否有其它的AR變異體與AR-V7共同表達，從而促進對AR靶向治療的抗性。為了解決這個瓶頸，明尼蘇達大學的研究團隊采用PacBio 單分子測序技術，無需片段化、無需組裝，直接對全長轉錄本進行測序，確定了完整的AR及AR轉錄本異構體的外顯子結構，并估算了它們的豐度。作者發現AR-V7和AR-V9通常在前列腺癌晚期患者中發生共表達，并且還發現，先前認為僅存在于AR-V7中的與可變剪切有關的外顯子，同樣存在于AR-V9 mRNA中。研究人員重新注釋了AR-V9 mRNA的結構，并進一步明確了AR-V9 mRNA的高表達可作為預測前列腺癌對靶向藥物醋酸阿比特龍發生抗性的生物標志物。
實驗流程：
實驗結果
1. AR-V7和AR-V9在前(qian)列腺癌細胞共表達(da)
AR典(dian)型外顯子(zi)1-8表(biao)達結果和預期(qi)的一樣，外顯子(zi)3下(xia)游部分高表(biao)達，包括CE3和CE5(圖1)。AR-V與AR mRNA相比缺少配體結合域(LBD)。
圖1 CPRC中AR基因(yin)結果(guo)
2. AR-V7和AR-V9 3’端外顯子結構分析
三代測(ce)序完善了AR基因的(de)外顯子結構(圖3)，此外，不(bu)同的(de)引物測(ce)序所得的(de)外顯子信(xin)息完整(zheng)性不(bu)同。
圖2 CPRC中(zhong)不同AR亞型(xing)的基(ji)因(yin)結構(gou)
3. AR-V7和AR-V9在CPRC共表達
圖(tu)3A是56位(wei)CPRC陽性(xing)病人(ren)(ren)(ren)(ren)轉移灶活(huo)檢結(jie)果。圖(tu)3B是12位(wei)接受阿比特龍或恩扎(zha)魯胺治療的(de)病人(ren)(ren)(ren)(ren)的(de)腫瘤(liu)循環細胞(bao)中(zhong)AR-V7和AR-V9情況。結(jie)果表明，AR陽性(xing)病人(ren)(ren)(ren)(ren)AR調控及前列腺癌相(xiang)關基因(yin)都(dou)有一定(ding)的(de)表達。部分病人(ren)(ren)(ren)(ren)往往存在AR-V7和AR-V9共表達現象。
圖3 AR-V7和AR-V9在CPRC共表達
4. 外顯(xian)子CE3 siRNA抑制AR-V9蛋白表達
圖4A顯示不同的(de)剪切方(fang)式形成了不同的(de)AR變異體(ti)，但(dan)是AR-V7和AR-V9之間存在overlap。siRNA(CE3或CE5)轉(zhuan)染22Rv1和VcaP細胞(bao)(bao)，提(ti)取(qu)RNA后進行RT-PCR，圖4B結(jie)(jie)果(guo)表明，轉(zhuan)染CE3 siRNA細胞(bao)(bao)的(de)AR-V7和AR-V9表達量都有所降低，而CE5 siRNA只影響了細胞(bao)(bao)中AR-V9的(de)表達量。轉(zhuan)染后細胞(bao)(bao)的(de)免疫沉淀結(jie)(jie)果(guo)和RT-PCR結(jie)(jie)果(guo)一致。
圖4 AR-V7和(he)AR-V9 3’UTR存(cun)在overlap
5. AR-V9激活并促進AR合成
慢病毒感染和細(xi)胞增殖實驗結果表明，AR-V9可促進CPRC細(xi)胞的AR非依賴性增殖，也就是說，如(ru)果在CPRC的(de)循環腫瘤細胞(bao)中檢測到了AR-V9的(de)話，那么這可能與(yu)患者對Enzalutamide存在(zai)耐藥性。
圖(tu)5 AR-V9作為(wei)AR的激活轉錄因子
2016年(nian)，派森諾(nuo)生物在原有的PacBio RS II三代高通量(liang)測序儀基礎(chu)上，率先部(bu)署最(zui)新款(kuan)PacBio Sequel測序儀，并(bing)已投入(ru)使用，助力全(quan)長轉(zhuan)錄組測序研究！
參考文獻
Kohli M, Ho Y, Hillman D W, et al. Androgen receptor variant AR-V9 is co-expressed with AR-V7 in prostate cancer metastases and predicts abiraterone resistance[J]. Clinical Cancer Research 2017.
