2020-12-29
免(mian)疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)針(zhen)對紛繁(fan)復雜的(de)入侵的(de)病原體（抗原）的(de)免(mian)疫反應，依賴于其(qi)高度多樣性的(de)抗原識別受體B細(xi)(xi)(xi)胞(bao)表(biao)面受體（B cell receptor ,BCR）和(he)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)表(biao)面受體（TCR）。BCR由四條肽鏈構(gou)成(cheng)，由兩條相同的(de)重(zhong)鏈和(he)兩條相同的(de)輕(qing)鏈連(lian)接而成(cheng)（重(zhong)鏈和(he)輕(qing)鏈分別由不同基(ji)因(yin)編(bian)碼），其(qi)中重(zhong)鏈分為可變(bian)區(qu)(Variable regions, V區(qu))、恒(heng)定區(qu)(Constant regions，C區(qu))、跨膜(mo)區(qu)及(ji)胞(bao)質區(qu)，而輕(qing)鏈則只有V區(qu)和(he)C區(qu)。TCR是高度多樣化的(de)異源二聚體，由大(da)多數T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)表(biao)達的(de)α和(he)β鏈（αβ TCR）的(de)組成(cheng)，或由外周血中的(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)（1-5%）和(he)在粘膜(mo)部(bu)位發(fa)現的(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)表(biao)達的(de)γδ鏈（γδ TCR）組成(cheng)。TCR α和(he)δ鏈的(de)可變(bian)區(qu)由多個(ge)可變(bian)的(de)（V）和(he)連(lian)接（J）基(ji)因(yin)編(bian)碼，而TCR β和(he)γ鏈由多樣性（D）基(ji)因(yin)編(bian)碼。
無論(lun)是BCR的(de)(de)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)還(huan)是重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)，都可(ke)以分為(wei)可(ke)變(bian)區(qu)(qu)(qu)（V區(qu)(qu)(qu)）和(he)恒(heng)定區(qu)(qu)(qu)（C區(qu)(qu)(qu)），其(qi)中V區(qu)(qu)(qu)由2~3個(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)拼接(jie)(jie)而成，具有(you)極(ji)高的(de)(de)多樣(yang)性，決定了BCR與(yu)抗原的(de)(de)結合能力。輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)的(de)(de)V區(qu)(qu)(qu)由V基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)和(he)J基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)構(gou)(gou)成；重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)除(chu)上述兩(liang)者之外，還(huan)有(you)一(yi)個(ge)D基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)。V、J基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)在(zai)個(ge)體胚系基(ji)(ji)(ji)因(yin)組上相互遠離(li)(li)。但(dan)在(zai)B細胞內(nei)，通過重(zhong)(zhong)排(pai)，原來相互遠離(li)(li)的(de)(de)V和(he)J基(ji)(ji)(ji)因(yin)區(qu)(qu)(qu)段(duan)(duan)(duan)接(jie)(jie)合產生(sheng)了連續的(de)(de)外顯(xian)(xian)子(zi)，其(qi)編(bian)碼(ma)整個(ge)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)V區(qu)(qu)(qu)。進(jin)一(yi)步在(zai)轉錄(lu)后，通過RNA剪接(jie)(jie)將(jiang)V區(qu)(qu)(qu)外顯(xian)(xian)子(zi)連接(jie)(jie)到C區(qu)(qu)(qu)外顯(xian)(xian)子(zi)上，構(gou)(gou)成完(wan)(wan)整的(de)(de)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)mRNA，進(jin)一(yi)步可(ke)以表(biao)達為(wei)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)蛋(dan)白(bai)。將(jiang)D基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)連接(jie)(jie)到J基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)形成DJ片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)，然(ran)后一(yi)個(ge)V基(ji)(ji)(ji)因(yin)片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)重(zhong)(zhong)排(pai)至DJ片(pian)(pian)段(duan)(duan)(duan)，形成一(yi)個(ge)完(wan)(wan)整的(de)(de)V區(qu)(qu)(qu)外顯(xian)(xian)子(zi)。然(ran)后與(yu)輕(qing)鏈(lian)(lian)(lian)基(ji)(ji)(ji)因(yin)一(yi)樣(yang)，RNA剪接(jie)(jie)將(jiang)組裝的(de)(de)V區(qu)(qu)(qu)序列連接(jie)(jie)到鄰近的(de)(de)C區(qu)(qu)(qu)序列形成完(wan)(wan)整的(de)(de)mRNA，進(jin)一(yi)步可(ke)以表(biao)達為(wei)重(zhong)(zhong)鏈(lian)(lian)(lian)蛋(dan)白(bai)。
TCRα類(lei)似BCR輕鏈編碼基因，含有(you)V和(he)(he)J基因片段(duan)（V α和(he)(he)J α）。TCRβ類(lei)似BCR重(zhong)鏈編碼基因，除(chu)Vβ和(he)(he)Jβ基因片段(duan)外，還含有(you)Dβ片段(duan)。同樣的，也是(shi)經歷通過DNA重(zhong)組和(he)(he)mRNA剪切兩個(ge)步驟，完成(cheng)了不同類(lei)別的TCR序(xu)列的表達。
當病原微生物入侵時，招募不同類別的免疫細胞，不同免疫細胞表達不同的轉錄組；此外，不同的B細胞和T細胞產生不同的BCR和TCR識別抗原，部分B細胞和T細胞擴增，形成具有相同BCR和TCR序列的多個細胞，該過程成為克隆型擴增。因此，當病原微生物入侵時，體內的免疫狀態呈現了多維度的異質性，此時，想要更精細地了解異質性信息，僅關注轉錄組已經無法滿足需求，針對BCR和TCR的VDJ序列的異質性，10Xgenomics公司推出了在cDNA的基礎上，進一步進行擴增子測序，通過分析BCR和TCR的不同序列，分析免疫環境中的克隆型多樣性，解析有機體抵制病原微生物入侵的免疫機制。
10Xgenomics的(de)(de)(de)單細(xi)胞(bao)BCR/TCR測(ce)序的(de)(de)(de)原(yuan)理，與(yu)單細(xi)胞(bao)轉(zhuan)錄組類似(si)，通(tong)(tong)過(guo)微流控系統(tong)將(jiang)帶(dai)有(you)(you)條(tiao)形碼和(he)(he)引(yin)物的(de)(de)(de)凝膠珠與(yu)單個細(xi)胞(bao)包裹(guo)在(zai)(zai)油滴中(zhong)；接(jie)下(xia)來在(zai)(zai)每個油滴內，凝膠珠溶解(jie)，細(xi)胞(bao)裂解(jie)釋放 mRNA，通(tong)(tong)過(guo)逆轉(zhuan)錄產生(sheng)帶(dai)有(you)(you) 10X barcode 和(he)(he) UMI 信(xin)息(xi)的(de)(de)(de) cDNA。破(po)油（Breaking Emulsions）之后，cDNA 一分(fen)為二(er)，后續同時進行基(ji)因表(biao)達和(he)(he)免(mian)疫組庫的(de)(de)(de)文庫構建。其中(zhong) TCR 或(huo)者 BCR 的(de)(de)(de) V(D)J 序列通(tong)(tong)過(guo)設計在(zai)(zai) C 區(qu)的(de)(de)(de)巢式(shi)引(yin)物進行 PCR 富集(ji)；而 mRNA 的(de)(de)(de)信(xin)息(xi)，與(yu) 10X Genomics 3’mRNA 文庫不同，保留的(de)(de)(de)是(shi) 5’端的(de)(de)(de)信(xin)息(xi)。測(ce)序后即可一次性獲得(de)大(da)量(liang)單細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)基(ji)因表(biao)達和(he)(he)免(mian)疫組庫數據。結合轉(zhuan)錄組測(ce)序數據與(yu)BCR/TCR多樣性數據，解(jie)析免(mian)疫細(xi)胞(bao)中(zhong)更(geng)高維度(du)的(de)(de)(de)異質(zhi)性。
樣本要求
1）細胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型：T細胞(bao)(bao)(bao)、PBMC、 B細胞(bao)(bao)(bao)、腫(zhong)瘤細胞(bao)(bao)(bao)；
2）細胞來源(yuan)：血(xue)液提取、磁珠富集、流式(shi)分選、組織解離、體外擴增、冷凍保存；
3）細胞(bao)大小(xiao)：直(zhi)徑(jing)<40 μm；
4）細(xi)胞濃度：5×105~1.2×106/ml；
5）細胞活(huo)性：>90%；
6）細(xi)胞(bao)數(shu)目：≥ 1×105 cells/sample。
7）保存(cun)運輸：為了減(jian)少運輸過程(cheng)及反(fan)復凍融對細胞(bao)造成的損傷(shang)，派森諾可(ke)提供上門服(fu)務！
