2020-12-30
經(jing)過上一(yi)篇-(點擊查看(kan))，相(xiang)信大家現在對DIA技術(shu)已經有(you)了一定了解。這一次我們趁熱打鐵，來(lai)康(kang)康(kang)DIA技術(shu)的應用。
一起來回顧下DIA技(ji)術的優(you)勢(shi)吧： 1、全景式(shi)掃(sao)描，數據無遺(yi)漏，蛋白(bai)質覆(fu)蓋(gai)率、定量準確性高； 2、樣(yang)本無需分餾(liu)分上機(ji)，極大縮短(duan)了(le)每個樣(yang)品的檢測周期；不受樣(yang)本量限制(zhi)，可用于(yu)大規模樣(yang)本數量檢測； 3、相比于DDA模(mo)式，DIA缺失值(zhi)更少，鑒定與定量結果的(de)可重復性更高，數據(ju)可回溯(su)。 DIA技術到(dao)底(di)行(xing)(xing)不行(xing)(xing)？下面我們來看一(yi)篇文章。 Optimization of Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry for Deep and Highly Sensitive Proteomic Analysis 研究對(dui)象(xiang)：人(ren)胚(pei)胎(tai)腎細胞；小鼠 期刊：Int J Mol Sci. 影響因子：4.556 發(fa)表時間：2019年11月 關鍵詞：DIA; 蛋白(bai)質組學; label-free定量 研(yan)究背景 生(sheng)物(wu)樣品中(zhong)蛋白質表(biao)達(da)的動態范圍非常廣，而且生(sheng)物(wu)學和醫學領域(yu)關(guan)注的的激酶和轉錄因子的表(biao)達(da)水平又較低(di)，所以(yi)蛋白質的鑒(jian)定和定量難度(du)(du)大大增加。因此本(ben)文通過優化DIA和LC的條件，建(jian)立了一套高靈(ling)敏度(du)(du)和覆(fu)蓋(gai)度(du)(du)的蛋白質組(zu)學分析流程(cheng)。 研究結果 1.蛋白質鑒定數量 DIA-MS比常規DDA-MS鑒(jian)定到更多的蛋白(bai)質(zhi)和肽(tai)段(duan)，其中oDIA-MS鑒(jian)定出(chu)的蛋白(bai)質(zhi)的肽(tai)段(duan)最(zui)多，其次是nDIA-MS（圖1A,B）。 圖1 鑒定的肽段(duan)和蛋白質組數目 （normal window DIA- nDIA，variable window DIA- vDIA，overlapping window DIA- oDIA） 2.DIA定(ding)量(liang)重現性以及準確性 樣品(pin)為人胚胎腎細胞（HEK293F digest），實驗做了8個重(zhong)復，并比較(jiao)不同重(zhong)復之間的(de)蛋白表達豐度(du)。皮爾森系(xi)數R≥0.99，變(bian)異系(xi)數中位數為4.41% （圖2 A,B），表明oDIA的(de)定(ding)量重(zhong)現性較(jiao)好。 圖2 皮爾森相關分析（A）和(he)CV柱狀圖（B） 樣品 A ：200 ng HEK293F digest 和 20 ng yeast digest，樣品B：200 ng HEK293F digest 和 10 ng yeast digest (圖3C)。如火山圖所示，human protein趨近于log20，yeast protein趨近于log21，表明了該技術較高的定量準確性。 圖3蛋(dan)白質表達豐度(du)火山圖 3. 低豐度蛋(dan)白 共鑒定出7868個(ge)蛋(dan)白(bai)組。其中有(you)(you)18個(ge)上(shang)調蛋(dan)白(bai)，27個(ge)下調蛋(dan)白(bai)，在GF（germ-free mice）和 SPF（specific pathogen-free mice）比較組中共有(you)(you)45個(ge)顯著(zhu)差異的蛋(dan)白(bai)質(圖4A,B)，其中包括Ino80c、Phf1、Ccnl2、Ern1和Hells等轉錄因(yin)子。此外有(you)(you)文獻報道，顯著(zhu)差異蛋(dan)白(bai)中的S100a9， Bhlhb9、Hmgcs2、Id、 Nqo1、Carns1、Rbm3和Dab1與神經性疾病有(you)(you)關(guan)。 圖4 GF vs SPF 火山圖和熱圖 總結 相(xiang)較于(yu)傳統的(de) DDA 定(ding)(ding)(ding)量(liang)，DIA 定(ding)(ding)(ding)量(liang)方(fang)法具有蛋白質覆蓋率和定(ding)(ding)(ding)量(liang)準確性高(gao)、不(bu)受樣本(ben)量(liang)限制，可用于(yu)大(da)規(gui)模樣本(ben)數(shu)量(liang)檢測、鑒定(ding)(ding)(ding)與定(ding)(ding)(ding)量(liang)結果的(de)可重復性更高(gao)、數(shu)據(ju)可回溯等(deng)優點(dian)。 鑒(jian)于 DIA 定(ding)量二級譜圖的(de)復雜(za)性，需(xu)要先采用 DDA 方(fang)式構建一個譜圖庫。建庫的(de)成(cheng)本稍高，對于大樣(yang)本量的(de)老(lao)師(shi)較為適用。畢竟，還有 money，你懂的(de)。
