2021-01-25
單細胞測(ce)序聯合空(kong)間轉(zhuan)錄組測(ce)序，拿到(dao)數(shu)據以(yi)后(hou)，到(dao)底如何進一(yi)步分(fen)析(xi)，才能發表高分(fen)文章？相信這個問(wen)題(ti)困擾(rao)著每一(yi)個研究者(zhe)。
今天，小編解讀(du)一(yi)篇最(zui)新(xin)發表于cell的(de)利用單(dan)(dan)細胞(bao)測(ce)序和(he)空間轉錄(lu)(lu)組測(ce)序解析人腸發育的(de)文章。看看大牛是(shi)如何(he)(he)分(fen)析單(dan)(dan)細胞(bao)測(ce)序結果和(he)空間轉錄(lu)(lu)組測(ce)序結果，如何(he)(he)將(jiang)兩者進(jin)行聯合分(fen)析，運(yun)用了什么樣(yang)(yang)的(de)研(yan)究思路，采用了什么樣(yang)(yang)的(de)分(fen)析方法，解釋發育過程中的(de)重要的(de)生物學問題。
作者針對(dui)17個胚胎的77個樣本進行(xing)了單細胞(bao)(bao)測序(xu)，捕(bu)獲到76592個細胞(bao)(bao)。這(zhe)(zhe)些(xie)細胞(bao)(bao)可(ke)以分(fen)成內皮(pi)，成纖維(wei)細胞(bao)(bao)，上皮(pi)，外周血(xue)，神經(jing)元(yuan)，肌肉，間充質細胞(bao)(bao)、肌成纖維(wei)細胞(bao)(bao)和免(mian)疫(yi)細胞(bao)(bao)9大類(lei)，并對(dui)各細胞(bao)(bao)類(lei)型的marker基因(yin)進行(xing)了分(fen)析(xi)。這(zhe)(zhe)些(xie)分(fen)析(xi)，屬于單細胞(bao)(bao)測序(xu)分(fen)析(xi)的標配。
不同細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)分化(hua)(hua)和(he)(he)(he)形成，是微(wei)環(huan)境中細(xi)胞(bao)(bao)(bao)外(wai)部因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)結合(he)到細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)受體(ti)上(shang)，完成了(le)外(wai)界信號(hao)傳遞(di)入細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，隨后依賴于轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)的(de)(de)(de)(de)表達和(he)(he)(he)轉(zhuan)錄(lu)調控(kong)，完成外(wai)界信號(hao)到基因(yin)(yin)(yin)(yin)表達的(de)(de)(de)(de)級(ji)聯調控(kong)，從而控(kong)制細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)分化(hua)(hua)和(he)(he)(he)發育。因(yin)(yin)(yin)(yin)此，作者對各個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)和(he)(he)(he)ligand-receptor關系進行了(le)細(xi)致的(de)(de)(de)(de)分析，鑒(jian)定了(le)多個(ge)(ge)決定細(xi)胞(bao)(bao)(bao)分化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)關鍵轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)和(he)(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)間通訊(xun)關系。
此外(wai)，作(zuo)者(zhe)針對(dui)5個樣本取(qu)了8張切片(pian)進行空間轉(zhuan)錄組(zu)測(ce)序(xu)(xu)。首先(xian)分(fen)析在(zai)不(bu)(bu)同(tong)(tong)空轉(zhuan)切片(pian)上(shang)，分(fen)別分(fen)布(bu)了哪些(xie)cluster。結合單細(xi)胞(bao)測(ce)序(xu)(xu)結果，分(fen)析關注的(de)(de)細(xi)胞(bao)類(lei)(lei)型在(zai)空轉(zhuan)切片(pian)上(shang)的(de)(de)分(fen)布(bu)，并(bing)比較(jiao)不(bu)(bu)同(tong)(tong)區(qu)域組(zu)織(zhi)在(zai)細(xi)胞(bao)類(lei)(lei)型分(fen)布(bu)上(shang)的(de)(de)異同(tong)(tong)。此外(wai)，比較(jiao)不(bu)(bu)同(tong)(tong)切片(pian)的(de)(de)相對(dui)應(ying)區(qu)域內(nei)的(de)(de)差(cha)異表(biao)達基(ji)因(yin)及其(qi)這(zhe)些(xie)基(ji)因(yin)富集的(de)(de)信號通路，揭示(shi)該區(qu)域內(nei)發生(sheng)的(de)(de)生(sheng)物學(xue)(xue)過程以及該生(sheng)物學(xue)(xue)過程在(zai)不(bu)(bu)同(tong)(tong)樣本間的(de)(de)差(cha)異。
作(zuo)者(zhe)隨(sui)(sui)后(hou)針(zhen)對(dui)重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)大群(qun)進行(xing)深入的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)，此處選取上(shang)(shang)(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)進行(xing)進一步(bu)分(fen)(fen)析(xi)。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)(fen)群(qun)結果(guo)顯示上(shang)(shang)(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)可以分(fen)(fen)成15個亞(ya)(ya)群(qun)，這15個亞(ya)(ya)群(qun)在(zai)不(bu)同(tong)部位(wei)、不(bu)同(tong)發(fa)(fa)育(yu)時期(qi)(qi)是呈現特異(yi)性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)布(bu)，并通過不(bu)同(tong)亞(ya)(ya)群(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)marker基因對(dui)亞(ya)(ya)群(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)類別(bie)進行(xing)判定。隨(sui)(sui)后(hou)針(zhen)對(dui)不(bu)同(tong)亞(ya)(ya)群(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數目進行(xing)分(fen)(fen)析(xi)，此處分(fen)(fen)析(xi)不(bu)同(tong)發(fa)(fa)育(yu)時期(qi)(qi)不(bu)同(tong)亞(ya)(ya)群(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)數目，結果(guo)顯示，近(jin)端(duan)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)遠端(duan)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)隨(sui)(sui)著發(fa)(fa)育(yu)過程(cheng)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數量逐(zhu)漸增多(duo)。那么，在(zai)早期(qi)(qi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)數目很低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時候，是什么細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)在(zai)執行(xing)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能(neng)呢(ni)？作(zuo)者(zhe)關注到早期(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)數量比較多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是近(jin)端(duan)上(shang)(shang)(shang)皮(pi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)祖細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。擬時序分(fen)(fen)析(xi)結果(guo)顯示上(shang)(shang)(shang)皮(pi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)祖細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)可發(fa)(fa)育(yu)為(wei)上(shang)(shang)(shang)皮(pi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。上(shang)(shang)(shang)皮(pi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)祖細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中表(biao)達(da)了(le)多(duo)個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)(fen)化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基因，如(ru)GATA4,TF,LGR5等，并對(dui)這些基因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)做(zuo)了(le)免(mian)疫組化驗證；對(dui)上(shang)(shang)(shang)皮(pi)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)起源，做(zuo)了(le)進一步(bu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)追溯。
分(fen)泌(mi)細(xi)胞(bao)在(zai)12周的(de)(de)胚(pei)胎中可(ke)被檢測(ce)到，并在(zai)之后完成(cheng)細(xi)胞(bao)數(shu)目的(de)(de)大量擴增，說(shuo)明(ming)其發(fa)育從12周開始。此外，通過(guo)ligand-receptor的(de)(de)分(fen)析(xi)，發(fa)現內分(fen)泌(mi)相(xiang)關的(de)(de)細(xi)胞(bao)可(ke)分(fen)泌(mi)ligand結(jie)合(he)到多種抑制性運動神經元細(xi)胞(bao)的(de)(de)受體，這個過(guo)程也(ye)是在(zai)12周的(de)(de)胚(pei)胎開始進行(xing)。以上結(jie)果說(shuo)明(ming)分(fen)泌(mi)細(xi)胞(bao)的(de)(de)多樣(yang)性在(zai)腸隱(yin)窩形成(cheng)過(guo)程中建(jian)立。
類似的思路，作者對內皮細胞進行了分群，通過比較不同發育時期的不同類別細胞的細胞數目，發現動脈細胞數目增多，說明在此過程中進行血管發育。針對marker基因的分析，ligand-receptor分析，鑒定ANGPT2是胚胎發育過程中血管形成的關鍵調控因子。
成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)(bao)可以(yi)重(zhong)新分(fen)群為(wei)S1,S2,S3,S4四個大群，其(qi)中(zhong)S3在胚胎(tai)發(fa)育時(shi)期的含(han)量特別多，所以(yi)作者(zhe)尤其(qi)關(guan)注了S3亞群。在擬時(shi)序結果(guo)中(zhong)顯(xian)示(shi)，未成(cheng)熟S3位于細(xi)胞(bao)(bao)演化(hua)的關(guan)鍵節點，一部分(fen)演化(hua)成(cheng)S3，一部分(fen)演化(hua)成(cheng)S1/2/4。進(jin)一步地，對S3細(xi)胞(bao)(bao)的ligand-receptor分(fen)析顯(xian)示(shi)，S3細(xi)胞(bao)(bao)通(tong)過LRP1受體與(yu)不同類別細(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行通(tong)訊。在空轉(zhuan)的結果(guo)上，可見LRP1與(yu)其(qi)ligand的共表達。
完成了(le)對(dui)不同(tong)類別細(xi)胞的(de)(de)(de)細(xi)致分(fen)析(xi)之后，揭示小腸這(zhe)(zhe)個組織的(de)(de)(de)形(xing)態建成的(de)(de)(de)調控(kong)機制，即(ji)分(fen)析(xi)不同(tong)細(xi)胞類型之間(jian)的(de)(de)(de)協(xie)同(tong)發育，應該(gai)是更(geng)具(ju)有生物學意(yi)義(yi)的(de)(de)(de)問題。作者建立(li)了(le)一個形(xing)成基(ji)因(yin)模塊(kuai)分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)，具(ju)體(ti)為以(yi)(yi)已(yi)經報(bao)道(dao)的(de)(de)(de)與發育相(xiang)關的(de)(de)(de)信號通路為起(qi)點，針(zhen)對(dui)單細(xi)胞測(ce)序的(de)(de)(de)轉錄組和(he)空轉的(de)(de)(de)轉錄組進行WGCNA分(fen)析(xi)，那(nei)么這(zhe)(zhe)些基(ji)因(yin)所在的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)module以(yi)(yi)及這(zhe)(zhe)些基(ji)因(yin)module里的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)，可能是參與這(zhe)(zhe)些發育過程的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)。
前人報道了S2型成纖維細胞通過表達TGF-β和WNT信號通路的ligand促進上皮細胞的發育。因此，表達了TGF-β和WNT信號通路的S2成纖維細胞成為研究重點。這些細胞中表達了TGF-β通路的BMP2,BMP4和BMP5以及WNT信號通路的WNT5A,WNT5B。那么，這些基因又成為了研究重點。分析這些基因所在的單細胞測序的module（module2）的基因，即共表達基因，篩選到DLL1,BMP5和NRG1。又通過ligand-receptr分析，發現S2成纖維細胞與上皮細胞形成具有較強的細胞間通訊。用類似的方法，作者對免疫細胞和S4成纖維細胞的發育以及病原微生物感染的發育過程進行了詳細的闡釋，這里不做進一步討論。
總(zong)結而(er)言，分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)方(fang)法，還是常用的分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)方(fang)法，如細(xi)胞分(fen)(fen)(fen)群，marker基(ji)因(yin)表達分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，擬時序分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，細(xi)胞間通(tong)訊分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，WGCNA分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)等。關(guan)鍵的問題(ti)(ti)是，到底關(guan)注哪(na)些(xie)(xie)(xie)(xie)細(xi)胞，關(guan)注哪(na)些(xie)(xie)(xie)(xie)基(ji)因(yin)。也就(jiu)是說，做這(zhe)些(xie)(xie)(xie)(xie)常規分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)時，到底挑選哪(na)些(xie)(xie)(xie)(xie)數據作為輸入文件？這(zhe)是一個研(yan)究過程中的關(guan)鍵問題(ti)(ti)。科研(yan)道路路漫漫其修遠兮，只有通(tong)過不斷地(di)思(si)考生(sheng)物學(xue)問題(ti)(ti)，提出生(sheng)物學(xue)問題(ti)(ti)，才能針對生(sheng)物學(xue)問題(ti)(ti)進行針對性地(di)分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)，才能解(jie)決生(sheng)物學(xue)問題(ti)(ti)。
