2021-01-27
很多小(xiao)伙(huo)伴拿(na)到轉錄(lu)組結果(guo)，都會有一個大(da)大(da)的疑(yi)問(wen)，明明上一步已經計算了(le)FPKM了(le)，為什么差異分析還是用readcount來做，我想用FPKM行不行？
這里，鄭重地回答你(ni)：不可以且沒必要！你(ni)熟悉的DESeq，DESeq2和EdgeR都(dou)表示不同意！他們都(dou)只認readcount！
首先，先讓(rang)你(ni)和(he)老朋友(you)FPKM再(zai)重(zhong)新熟悉一(yi)(yi)下：由于不(bu)同樣(yang)品(pin)(pin)過濾后獲得的(de)數(shu)據(ju)量(liang)(liang)是(shi)(shi)不(bu)可能完全一(yi)(yi)致(zhi)的(de)，不(bu)同基(ji)因(yin)長度(du)(du)也有(you)很大差(cha)異。因(yin)此(ci)為了(le)能夠在樣(yang)品(pin)(pin)內比(bi)較基(ji)因(yin)的(de)表達量(liang)(liang)，需要采(cai)用FPKM 對表達量(liang)(liang)進(jin)行標準化（Normalization）：FPKM（Fragments Per Kilobase Million），為每百萬 Reads 中來(lai)自某一(yi)(yi)基(ji)因(yin)每千(qian)堿基(ji)長度(du)(du)的(de) Reads 數(shu)目，是(shi)(shi)一(yi)(yi)種普遍采(cai)用的(de)基(ji)因(yin)表達量(liang)(liang)標準化方法(fa)，這種方法(fa)同時考慮了(le)測序深度(du)(du)和(he)基(ji)因(yin)長度(du)(du)對基(ji)因(yin)表達量(liang)(liang)計數(shu)的(de)影(ying)響(xiang)。其計算公式如下(xia)：
敲黑(hei)板！FPKM考慮到基(ji)因長度(du)對基(ji)因表達量計數的影響，但是在(zai)進行差異分析(xi)時，同(tong)一(yi)個基(ji)因在(zai)不(bu)(bu)同(tong)樣本中的表達差異根(gen)本不(bu)(bu)需要考慮這(zhe)條(tiao)基(ji)因的長度(du)！！！差異分析(xi)需要均(jun)一(yi)化的是不(bu)(bu)同(tong)處(chu)理(li)中的基(ji)因，FPKM均(jun)一(yi)化的則是這(zhe)個樣本中的所有基(ji)因，硬要讓(rang)FPKM去(qu)做(zuo)不(bu)(bu)屬于他的工(gong)作，小心出現(xian)大問題！口說(shuo)無憑，這(zhe)里(li)我們隨機抽取(qu)了同(tong)一(yi)個項(xiang)目(mu)的兩組(zu)幸運數據(ju)，每組(zu)3個重復，直接來驗證一(yi)下： 同樣的(de)(de)兩組數據，我們分別用(yong)readcount和FPKM進行差(cha)異分析，分別得到了324個和275個“差(cha)異基因”，光看數目是(shi)不是(shi)好像差(cha)別不大？可是(shi)這些(xie)基因中，只有123個是(shi)相同的(de)(de)，所以(yi)如果你用(yong)FPKM強行做了差(cha)異分析，那么得出的(de)(de)結果，可與用(yong)readcount的(de)(de)差(cha)異分析結果大相徑庭。你以(yi)為(wei)得到的(de)(de)是(shi)孫悟空(kong)，其實根(gen)本(ben)就是(shi)披著孫悟空(kong)馬(ma)甲(jia)的(de)(de)六耳獼猴！ 這里可能小伙(huo)伴又(you)疑惑(huo)了起(qi)來，FPKM又(you)不(bu)能做差異，我要(yao)他有什么用？？？ No No No，想(xiang)要(yao)(yao)(yao)比(bi)較同一個樣本中所有(you)基因(yin)誰的(de)表達量更(geng)高更(geng)強(qiang)，還(huan)是(shi)要(yao)(yao)(yao)FPKM出(chu)馬。以及你熟(shu)悉(xi)的(de)樣品相(xiang)關性(xing)分析、熱圖和WGCNA，他們(men)通(tong)通(tong)都需要(yao)(yao)(yao)FPKM的(de)支持(chi)！ 因此，分析中無論是(shi)(shi)選用FPKM，還是(shi)(shi)readcount，都(dou)是(shi)(shi)經過統計(ji)學家，軟(ruan)件(jian)開發(fa)人員和(he)分析人員的(de)反復(fu)驗證，深思(si)熟慮選用的(de)，所以如果你的(de)結果還是(shi)(shi)不太滿意，是(shi)(shi)不是(shi)(shi)也想(xiang)(xiang)想(xiang)(xiang)實(shi)驗？ 以上結(jie)果(guo)僅供參考(kao)！
