2017-08-10
近年來隨著(zhu)二代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)發展(zhan)成熟和(he)三(san)代(dai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)興起(qi)(qi)、信息分析方(fang)法和(he)工具(ju)的(de)(de)發展(zhan)完善，基(ji)(ji)于(yu)全基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)進(jin)(jin)(jin)行動植物群體的(de)(de)進(jin)(jin)(jin)化研(yan)究(jiu)(jiu)、構建遺(yi)傳圖譜(pu)、檢測(ce)(ce)目標性(xing)狀相(xiang)(xiang)關基(ji)(ji)因(yin)(yin)已成為常(chang)用的(de)(de)策(ce)略。應注意(yi)到，基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)是一(yi)個物種研(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)起(qi)(qi)點(dian)和(he)基(ji)(ji)礎(chu)，更深入的(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)通(tong)常(chang)涉(she)及以(yi)下幾方(fang)面的(de)(de)分析：序(xu)(xu)列(lie)組(zu)裝、基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)特征(zheng)、注釋效(xiao)果功能基(ji)(ji)因(yin)(yin)和(he)通(tong)路研(yan)究(jiu)(jiu)、進(jin)(jin)(jin)化分析、比(bi)較(jiao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)學分析、全基(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)復制事件（WGD）、物種起(qi)(qi)源(yuan)、馴化、群體遺(yi)傳等。在這里，我(wo)們針(zhen)對基(ji)(ji)于(yu)de novo測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)(de)植物進(jin)(jin)(jin)化相(xiang)(xiang)關研(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)最新進(jin)(jin)(jin)展(zhan)和(he)重(zhong)要文(wen)獻作(zuo)了簡要的(de)(de)梳理，以(yi)便為項(xiang)目提供參考。
1. 植物基因組denovo測序(xu)技術概述
基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)從頭(tou)測(ce)序(xu)(xu)（de novo sequencing）是指對(dui)(dui)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)序(xu)(xu)列未(wei)知或(huo)沒有近緣物(wu)種基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)的(de)某個物(wu)種的(de)全基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)序(xu)(xu)列的(de)測(ce)序(xu)(xu)。不需要參考(kao)資料，測(ce)序(xu)(xu)后用生物(wu)信息(xi)學(xue)手段對(dui)(dui)測(ce)序(xu)(xu)序(xu)(xu)列進行(xing)拼接(jie)、組(zu)(zu)(zu)裝和注釋，從而獲得該(gai)物(wu)種的(de)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)序(xu)(xu)列圖譜。目前常用的(de)測(ce)序(xu)(xu)平(ping)臺包(bao)括(kuo)二代(dai)和三(san)代(dai)，如(ru)Illumina HiSeq、Illumina MiSeq、PacBio RS、PacBio Sequel等。
植物(wu)(wu)基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)通常是(shi)(shi)多倍體(ti)，基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)大，雜合度(du)高，具有(you)高度(du)重(zhong)復(fu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)和(he)全(quan)部或部分的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)重(zhong)復(fu)片段，這(zhe)些特點造成了(le)其基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)測(ce)序(xu)(xu)(xu)組(zu)(zu)(zu)(zu)裝的(de)(de)(de)難度(du)。目前(qian)已(yi)發表的(de)(de)(de)植物(wu)(wu)基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)大多是(shi)(shi)基于短(duan)(duan)讀長(chang)測(ce)序(xu)(xu)(xu)組(zu)(zu)(zu)(zu)裝，結(jie)果碎片化。對(dui)此，三代測(ce)序(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術，即PacBio單分子實(shi)時(shi)（SMRT）測(ce)序(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術的(de)(de)(de)出現有(you)助于可以解(jie)決(jue)這(zhe)一問題。三代測(ce)序(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術解(jie)決(jue)了(le)二代測(ce)序(xu)(xu)(xu)高GC區(qu)域(yu)無法準確測(ce)定、高重(zhong)復(fu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)無法跨越(yue)、海量(liang)短(duan)(duan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)組(zu)(zu)(zu)(zu)裝困(kun)難等(deng)幾大困(kun)擾，超長(chang)的(de)(de)(de)讀長(chang)不(bu)僅給GC含(han)量(liang)異常和(he)高重(zhong)復(fu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)組(zu)(zu)(zu)(zu)裝提供了(le)很好的(de)(de)(de)契機，而且能(neng)夠大幅(fu)度(du)提高已(yi)有(you)基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)(de)(de)組(zu)(zu)(zu)(zu)裝指標。目前(qian)，三代結(jie)合二代測(ce)序(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術是(shi)(shi)基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)從頭測(ce)序(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)選擇，大規模地物(wu)(wu)種(zhong)全(quan)基因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)(zu)denovo測(ce)序(xu)(xu)(xu)已(yi)漸入佳境。
測(ce)序(xu)流程如下：
2. 數據組(zu)裝
高(gao)等(deng)植物基(ji)因組(zu)(zu)常為高(gao)度(du)雜合，為測序(xu)(xu)數據的組(zu)(zu)裝帶(dai)來一定(ding)挑戰。針(zhen)對這一問題，常用的研究方法是通過選擇雙單倍體(ti)或構建(jian)高(gao)純(chun)合度(du)的自交系進行測序(xu)(xu)來降(jiang)低(di)組(zu)(zu)裝難度(du)。
2.1 組裝方法
常用組裝軟件(jian)有MaSuRCA、SOAPdenovo2、Opera、Platanus、SSPACE、GapCloser等。
其(qi)中(zhong)，MaSuRCA軟件可對短(duan)序(xu)列(lie)和長序(xu)列(lie)聯合分析(xi)，通過產生superreads提(ti)高計算效(xiao)率(lv)和容錯(cuo)度。SOAPdenovo2軟件適用于(yu)大基因組，可減少(shao)構圖過程(cheng)中(zhong)的內存(cun)消耗(hao)，提(ti)高gap覆(fu)蓋(gai)度。SSPACE軟件特點(dian)是運行(xing)時間短(duan)，可實現雙端測序(xu)數據集的多重文(wen)庫輸入(ru)和contig延長。
2.2 組裝結果
組(zu)裝(zhuang)結(jie)果常用contig N50、scaffold N50、superscaffold、基因組(zu)覆(fu)蓋度等指(zhi)標代表。
2.3 組裝效果評估
常用評估方法有：CEGMA、EST、BAC、RNA-Seq、EST+RNA-Seq等(deng)。
3. 基于Denovo測序(xu)的高等植(zhi)物進化研究進展
3.1 核桃全基因組倍增事件驗證（The Plant Journal，2016年9月）
化石證據表(biao)明胡桃(tao)屬WGD發生于60百萬年前(qian)（Mya），利用(yong)核(he)桃(tao)全基因組測序結果(guo)，采用(yong)自我比(bi)對(dui)的(de)(de)方法，鑒定基因組部分同源序列間(jian)(jian)的(de)(de)共(gong)線(xian)性保(bao)守區，識別到(dao)8459對(dui)旁(pang)(pang)系(xi)同源基因，其中4111對(dui)相關(guan)基因涉及轉錄調(diao)控蛋白(bai)和信號傳(chuan)導蛋白(bai)的(de)(de)編碼，對(dui)這些基因（Ks<1）構建Ks直方圖，圖中主(zhu)峰位置在Ks=0.33。研究結果(guo)與14對(dui)旁(pang)(pang)系(xi)同源基因的(de)(de)分歧(qi)時間(jian)(jian)一致(Ks = 0.274±0.09) (Luo et al., 2015)，為WGD提供了有力支持。但還需通過種間(jian)(jian)比(bi)較(jiao)精確確定系(xi)統發育的(de)(de)時間(jian)(jian)。
3.2 茄科(ke)植物(wu)進化與辣(la)椒馴化（PNAS，2014年8月）
采用OrthoMCL方(fang)法進行基因家族的(de)種間(jian)比較（辣椒(jiao)、番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)、馬鈴(ling)薯(shu)、擬(ni)南(nan)芥）構建單(dan)拷(kao)(kao)貝同源(yuan)基因的(de)系統進化樹，發現(xian)(xian)在36Mya辣椒(jiao)與番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)、馬鈴(ling)薯(shu)分離，即(ji)茄(qie)(qie)(qie)科辣椒(jiao)屬形(xing)成，期間(jian)發生了(le)辣椒(jiao)染色體(ti)易位、倒位等(deng)變異，156Mya茄(qie)(qie)(qie)科出現(xian)(xian)，緊隨著(zhu)單(dan)、雙子葉植物的(de)分離。與葡萄比較發現(xian)(xian)了(le)辣椒(jiao)基因組(zu)三倍(bei)化，這可能(neng)是茄(qie)(qie)(qie)科的(de)共(gong)同事件，但三倍(bei)化后出現(xian)(xian)了(le)基因拷(kao)(kao)貝的(de)丟失(shi)。通(tong)過4DTv方(fang)法計算WGD時間(jian)，WGD峰出現(xian)(xian)在0.3位置。
辣(la)椒馴化研究選(xuan)擇(ze)了18個(ge)栽(zai)培(pei)品種和2個(ge)野生(sheng)/半野生(sheng)品種，通過(guo)遺傳瓶頸法鑒定人工(gong)選(xuan)擇(ze)標記(ji)，通過(guo)θπ、θω值檢測遺傳多(duo)(duo)樣(yang)性(xing)降低鑒定了115個(ge)人工(gong)選(xuan)擇(ze)區域（含511個(ge)基因），其(qi)多(duo)(duo)態性(xing)水平(ping)顯著降低，相關(guan)基因功能涉及(ji)轉錄(lu)調節、脅迫與防御響應、蛋白-DNA復(fu)合物(wu)裝配、生(sheng)長(chang)和果實發育(yu)等，與栽(zai)培(pei)種與野生(sheng)種的(de)形態和生(sheng)理差異相關(guan)。
3.3 錦葵(kui)科植(zhi)物基(ji)因(yin)組結(jie)構與多倍化（DNA Research，2017年2月）
MCScanX檢(jian)測共線(xian)性模(mo)塊(kuai)，以可可樹基(ji)因組為模(mo)板(ban)，檢(jian)測木(mu)(mu)槿(jin)(jin)和雷蒙(meng)德(de)氏棉(mian)的(de)共線(xian)性模(mo)塊(kuai)，發現木(mu)(mu)槿(jin)(jin)共線(xian)性模(mo)塊(kuai)的(de)數目是(shi)雷蒙(meng)德(de)氏棉(mian)的(de)4倍，大小為其2倍，表明(ming)木(mu)(mu)槿(jin)(jin)中出(chu)現過WGD。系統發育(yu)分析(xi)揭示基(ji)因組復(fu)制(zhi)模(mo)式，GI、CONSTANS和SOC1等基(ji)因復(fu)制(zhi)表明(ming)木(mu)(mu)槿(jin)(jin)中出(chu)現了3次(ci)WGD，但很多基(ji)因在第一次(ci)復(fu)制(zhi)后出(chu)現丟失。
通過BEACT構建(jian)系統發育(yu)樹(shu)，計算Ks并估(gu)算錦(jin)葵(kui)科(ke)分(fen)(fen)(fen)離時(shi)間，結果表明91.1Mya錦(jin)葵(kui)科(ke)從(cong)十字花科(ke)-錦(jin)葵(kui)科(ke)共同(tong)祖先分(fen)(fen)(fen)化(hua)出(chu)來，木槿(jin)在物種形成前、物種形成后25.23~48.23Mya和4.61~21.15Mya的(de)時(shi)間內分(fen)(fen)(fen)別(bie)出(chu)現(xian)3次WGD，WGD與隨后的(de)二倍化(hua)導致(zhi)基因量(liang)不均衡調節(jie)和基因家族(zu)CNV。
3.4 甜橙基因組進化（Nature Genetics，2013年1月）
旁系同源基(ji)因家族的(de)累積大小(xiao)和頻率可作為(wei)WGD的(de)標(biao)記，通過自我比(bi)對鑒定(ding)了1296個(ge)旁系同源基(ji)因，復制基(ji)因的(de)平均(jun)Ks值表明遠古(gu)WGD事件，沒有近(jin)期WGD。進一步基(ji)于種(zhong)間共線性模塊(kuai)，估(gu)算了至少(shao)49個(ge)染色體易(yi)位與融(rong)合(he)為(wei)雙子葉植(zhi)物(wu)共有，系統發(fa)育顯示甜橙、可可樹、擬南芥和番木瓜近(jin)緣，柑(gan)橘屬(shu)在(zai)85Mya從錦(jin)葵(kui)目分離。
雜交(jiao)和多(duo)倍(bei)化(hua)是植(zhi)物(wu)最重(zhong)要的(de)進化(hua)方(fang)式之一。總結以(yi)上文章的(de)研(yan)究(jiu)思路，我們可以(yi)看到通常一個植(zhi)物(wu)基因(yin)組項(xiang)目(mu)進化(hua)分(fen)析(xi)的(de)關注點包括(kuo)全基因(yin)組復(fu)制(zhi)事件(jian)、同源比對以(yi)研(yan)究(jiu)古(gu)多(duo)倍(bei)化(hua)、自身比對以(yi)研(yan)究(jiu)近(jin)多(duo)倍(bei)化(hua)、系(xi)統發育(yu)樹構建(jian)以(yi)研(yan)究(jiu)群體聚類和起源等(deng)。對于具體項(xiang)目(mu)而言，可根據關心的(de)問(wen)題(ti)和物(wu)種(zhong)特性選擇相應的(de)分(fen)析(xi)方(fang)法。
參考文獻
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