2021-03-22
目前，單細(xi)胞(bao)測序(xu)這項技術(shu)被應(ying)用的越來越多，領域包括(kuo)了神(shen)經科(ke)學、腫瘤免疫(yi)、胚(pei)胎發育等等，您是否也計劃(hua)著開(kai)展相關(guan)的研究呢？心中(zhong)關(guan)于單細(xi)胞(bao)的疑惑就讓小(xiao)編(bian)帶(dai)您從常見問題(ti)出發，逐步撥開(kai)迷(mi)霧吧。
問(wen)1、為什么要做單(dan)細胞測序？
細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)與細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)之(zhi)間(jian)的(de)異質性(xing)，微(wei)環境里的(de)細(xi)(xi)(xi)微(wei)差(cha)別，這(zhe)些我們關注的(de)信息都(dou)會被常規Bulk測序(xu)所掩蓋，而單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)水平(ping)可(ke)以將細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)一一分開，找到差(cha)異。單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)測序(xu)首將深入到細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內部，觀察每一個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)差(cha)別和相似，除了基因層面，我們也可(ke)以在細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)層面和細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類群層面進行多維度的(de)解析。
問2、單(dan)細胞測序對(dui)送樣有什(shen)么要求？
制備(bei)好的(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸液或(huo)血(xue)液、組(zu)織均可，質(zhi)量要求：細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性(xing)(xing)大(da)于(yu)80%，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)濃度(du)介于(yu)5*10^5—1.2*10^6/ml，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)總數(shu)最好大(da)于(yu)10^5個，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養(yang)基及緩沖液不(bu)能含Ca2+和(he)Mg2+，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)體積需小于(yu)40μm，大(da)于(yu)5μm。不(bu)同(tong)物(wu)種(zhong)、不(bu)同(tong)組(zu)織，包含的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型多種(zhong)多樣。針對同(tong)一個組(zu)織，根(gen)據研(yan)究的(de)生物(wu)學問題，對不(bu)同(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)別(bie)的(de)需求也是千(qian)差(cha)萬別(bie)。派森(sen)諾的(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸液制備(bei)研(yan)發團隊，針對不(bu)同(tong)的(de)物(wu)種(zhong)、不(bu)同(tong)的(de)組(zu)織類(lei)型、不(bu)同(tong)的(de)實驗處理(li)方(fang)式(shi)、不(bu)同(tong)的(de)感興趣的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)類(lei)型設計一對一高度(du)個性(xing)(xing)化的(de)解離方(fang)案。取樣細(xi)(xi)節、運輸細(xi)(xi)節，方(fang)方(fang)面面，為您高度(du)個性(xing)(xing)化的(de)研(yan)究保駕(jia)護(hu)航。
問3、細(xi)胞懸液的(de)制備(bei)過程中是否會(hui)影(ying)響基因(yin)的(de)表達？
目前(qian)常用的(de)方法(fa)中(zhong)，不(bu)管是酶消化還是機械操作(zuo)都會(hui)不(bu)可(ke)避免的(de)對(dui)細(xi)胞(bao)(bao)產(chan)生影(ying)響，前(qian)者(zhe)會(hui)使細(xi)胞(bao)(bao)產(chan)生應激(ji)反應，后者(zhe)則容易(yi)損(sun)傷細(xi)胞(bao)(bao)，進而影(ying)響細(xi)胞(bao)(bao)活(huo)性。所以(yi)(yi)，在(zai)單細(xi)胞(bao)(bao)測序實驗(yan)設(she)計時，設(she)置對(dui)照是非常重要的(de)。前(qian)述的(de)這些(xie)影(ying)響，在(zai)case和control中(zhong)同樣存(cun)在(zai)，我(wo)們(men)關注case和control的(de)差異(yi)表達(da)基因(yin)，就可(ke)以(yi)(yi)去(qu)除實驗(yan)的(de)系統誤差，找到決定感興趣(qu)生物(wu)學過程的(de)關鍵基因(yin)。
問(wen)4.、10XGenomics單細胞平(ping)臺(tai)有(you)什么優勢？
一.細胞(bao)通量高，一次可捕(bu)獲上萬細胞(bao) ；
二.對(dui)細胞大小及類型限制低，且捕(bu)獲效(xiao)率高達(da)65% ；
三.從懸液(ye)到(dao)文庫構(gou)建周期短(duan)。
問(wen)5、如何判(pan)定數(shu)據質量？
拿到一個高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)數(shu)據，第一步是需要(yao)獲得高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸液。單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸液的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性，要(yao)求大于80%。目(mu)前常用的(de)是AO/PI染色和臺盼藍染色法。相比較(jiao)而(er)言(yan)，臺盼藍染色會有一定(ding)的(de)假(jia)陰性。針(zhen)對用臺盼藍染色做的(de)植(zhi)物原生質(zhi)體的(de)活性測定(ding)，假(jia)陰性的(de)比例會更高(gao)。因為富含葉綠體的(de)植(zhi)物細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在臺盼藍染色后顏(yan)色更深，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)計數(shu)儀會被判定(ding)為死細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。因此，經驗(yan)豐富的(de)操(cao)作(zuo)人員檢(jian)查細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)狀態，也是非常重要(yao)的(de)一步。第二步是需要(yao)捕(bu)獲到足(zu)夠數(shu)量(liang)的(de)高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。關于這(zhe)一點的(de)質(zhi)控(kong)標(biao)準，可結合下圖(tu)做個闡釋(shi)。
1、捕獲到的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)數(shu)(shu)量：這是單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)測序(xu)研(yan)究的(de)重(zhong)要(yao)參數(shu)(shu)。捕獲到的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)數(shu)(shu)量越(yue)多(duo)，證據(ju)越(yue)充分(fen)，越(yue)有利(li)于發表高分(fen)文(wen)章。在后續分(fen)析(xi)過(guo)程中(zhong)，會再(zai)做一次細(xi)(xi)(xi)胞(bao)過(guo)濾，最終(zhong)得(de)到的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)數(shu)(shu)目，即是每一篇(pian)單(dan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)測序(xu)文(wen)章都會描述的(de)捕獲到的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)數(shu)(shu)目。
2、是(shi)細胞中(zhong)的(de)平均reads數(shu)，相當于測序深度，一(yi)般大于3萬是(shi)比(bi)較好的(de)數(shu)據(ju)。
3、是(shi)細(xi)胞中的(de)中位(wei)基(ji)因值(zhi)，該值(zhi)的(de)大小與不同(tong)的(de)組(zu)織樣本(ben)有關，如癌細(xi)胞中可(ke)能數(shu)值(zhi)較(jiao)高。
4、是測序(xu)的飽和(he)度，一般大于(yu)50%即(ji)可。
5、是(shi)本次測序得到(dao)的reads比對(dui)到(dao)高質量細胞(bao)(bao)的占比，也(ye)是(shi)后續用來分析的數(shu)據。如果細胞(bao)(bao)活性偏低，細胞(bao)(bao)破(po)裂較多(duo)，游(you)離到(dao)環境中的mRNA偏多(duo)，這個數(shu)值會偏低。
問6、如何判斷細胞類型？
細胞類(lei)型(xing)的判斷是需要您(nin)自己選擇Marker基因的，您(nin)可以參(can)考同類(lei)物種(zhong)或(huo)樣本(ben)的已發表(biao)文章(zhang)，或(huo)者根(gen)據數據庫去確定Marker，比如CellMarker，panglao等(deng)。
結 語
細胞是生命活(huo)動的基本單(dan)位，而如今科技的發(fa)展(zhan)讓我們有(you)(you)能力有(you)(you)機會去對它(ta)進行探(tan)索，去一展(zhan)它(ta)的全貌，去窺探(tan)復(fu)雜(za)生命背后的深層機制，我們相(xiang)信(xin)在未來(lai)較長(chang)的一段(duan)時間內，隨著單(dan)細胞測序(xu)的發(fa)展(zhan)及(ji)數(shu)據(ju)的積(ji)累，關于(yu)表型(xing)(xing)、基因型(xing)(xing)與環境之間的脈絡會越來(lai)越清晰，讓我們能更加深入的了解自(zi)然了解自(zi)己。
