2021-04-02
對于QIIME 2云分析(xi)，我們(men)悉心整理了各個(ge)分析(xi)模塊中的(de)熱點分析(xi)內容，推出了“5分鐘小課堂系列”。此前已帶(dai)來了第(di)1講（）和第2講（），對(dui)物種組成分析(xi)、Alpha多(duo)(duo)樣性分析(xi)和Beta多(duo)(duo)樣性分析(xi)進(jin)(jin)行了解(jie)讀(du)。今(jin)天我們更進(jin)(jin)一步(bu)，幫助大家掌握物種差異分析(xi)的具體方法，找(zhao)到標志物種（Biomarker）！
如前所述，Alpha/Beta多(duo)樣性(xing)分(fen)析主要用于比(bi)較(jiao)各樣本/分(fen)組中，微(wei)生物群(qun)落在(zai)多(duo)樣性(xing)水(shui)平和整(zheng)體結構上的(de)(de)差異(yi)。當我們通過Alpha多(duo)樣性(xing)指數的(de)(de)箱線圖(tu)分(fen)析、或是(shi)Beta多(duo)樣性(xing)的(de)(de)PCoA/NMDS分(fen)析，發現存在(zai)顯著的(de)(de)組間差異(yi)時，我們通常需要進一步關注：具體是(shi)哪些(xie)微(wei)生物物種(zhong)存在(zai)組間差異(yi)呢？
這時候，我們的(de)“物(wu)種(zhong)差(cha)異與標志物(wu)種(zhong)分析”，就可以大顯身(shen)手啦！
1. 韋恩圖分析
在(zai)微生物(wu)組研究中(zhong)，韋恩圖通常(chang)用于分(fen)析不(bu)同的(de)(de)樣本(ben)（組）間有(you)哪些(xie)物(wu)種是(shi)共有(you)的(de)(de)、哪些(xie)是(shi)獨有(you)的(de)(de)，在(zai)文獻中(zhong)的(de)(de)出鏡(jing)率也(ye)非常(chang)高。云(yun)分(fen)析中(zhong)，每(mei)個樣本(ben)（組）作為一個集(ji)合，根據ASV/OTU在(zai)各樣本(ben)（組）間的(de)(de)有(you)無情況(kuang)分(fen)別統計各個集(ji)合的(de)(de)成員數，也(ye)就是(shi)各個分(fen)組獨有(you)的(de)(de)、以及組間共有(you)的(de)(de)ASV/OTU的(de)(de)個數（注意不(bu)是(shi)豐(feng)度值(zhi)）。
圖中，每個(ge)色塊代表一個(ge)分組，色塊間的重疊(die)區域指示(shi)相應樣本（組）間所共有的ASV/OTU，每個(ge)區塊的數(shu)(shu)字指示(shi)該區塊所包含的ASV/OTU的數(shu)(shu)目。
此外(wai)，韋(wei)恩圖(tu)有多(duo)種展現形式，包(bao)括花瓣圖(tu)、齒輪韋(wei)恩圖(tu)等，都可以通過“圖(tu)表調整”模塊(kuai)來實現圖(tu)形修改。
我(wo)們還可(ke)以(yi)(yi)對門/綱/目/科/屬等(deng)分(fen)類水(shui)平的(de)物種(zhong)組成，進行韋(wei)恩圖分(fen)析，我(wo)們此前也已做過(guo)作圖方法(fa)介紹，大家也可(ke)以(yi)(yi)參考哦(e)（）~
2. 熱圖和隨(sui)機森林分析
熱圖是(shi)數據(ju)(ju)可視化(hua)的常用(yong)方法之一，也(ye)是(shi)挖掘多維復雜數據(ju)(ju)變(bian)化(hua)規(gui)律的重要手(shou)段。我們可以將熱圖應用(yong)于ASV/OTU、各(ge)(ge)分(fen)類水(shui)平(ping)的物種注釋結果（如門(men)/綱/目(mu)/科/屬/種豐(feng)度(du)組(zu)成）等各(ge)(ge)個層(ceng)面的分(fen)析中(zhong)(zhong)，以展現各(ge)(ge)樣本（組(zu)）中(zhong)(zhong)物種豐(feng)度(du)的變(bian)化(hua)規(gui)律。QIIME2云分(fen)析流程自帶“物種組(zu)成熱圖”和“隨(sui)機森林分(fen)析熱圖”，可以根據(ju)(ju)研究需要，隨(sui)心(xin)調整出圖效(xiao)果：
隨機(ji)森(sen)林是一(yi)種基于(yu)決策樹（Decision tree）的高效的機(ji)器學習算法（Machine-learning methods），屬于(yu)非線(xian)(xian)性(xing)分(fen)類(lei)器（Non-linear classifier），能(neng)夠深入(ru)挖掘變量(liang)之(zhi)間復雜的非線(xian)(xian)性(xing)相(xiang)互依賴關系，對于(yu)經常(chang)呈現離散、不連(lian)續分(fen)布的微(wei)生(sheng)物群落數據而言尤其適用。
通過(guo)隨(sui)機森林分(fen)(fen)析，我們可以篩選對(dui)組(zu)間(jian)差(cha)(cha)異具有重要影響(xiang)的(de)(de)標(biao)志(zhi)物種(zhong)(zhong)，默(mo)認(ren)展示的(de)(de)是(shi)(shi)(shi)重要度排名前20的(de)(de)標(biao)志(zhi)物種(zhong)(zhong)（可以是(shi)(shi)(shi)ASV/OTU，也可以是(shi)(shi)(shi)門/綱/目/科(ke)/屬/種(zhong)(zhong)的(de)(de)分(fen)(fen)類水平）。結(jie)果圖由左右(you)兩部分(fen)(fen)組(zu)成，左側為每(mei)個(ge)標(biao)志(zhi)物種(zhong)(zhong)對(dui)應的(de)(de)豐(feng)度熱圖，而右(you)側則是(shi)(shi)(shi)每(mei)個(ge)標(biao)志(zhi)物種(zhong)(zhong)的(de)(de)重要度得分(fen)(fen)值柱狀圖，柱子越長(chang)，表(biao)明(ming)該(gai)標(biao)志(zhi)物種(zhong)(zhong)對(dui)于組(zu)間(jian)差(cha)(cha)異影響(xiang)的(de)(de)重要性(xing)(xing)越大(da)；從上到下，物種(zhong)(zhong)對(dui)組(zu)間(jian)差(cha)(cha)異影響(xiang)的(de)(de)重要性(xing)(xing)依次遞減。
3. PCA和OPLS-DA分析
PCA和OPLS-DA分析基于物種(zhong)(zhong)組(zu)成(cheng)信息（門/綱/目/科/屬/種(zhong)(zhong)），可(ke)用于分析組(zu)間差異，并篩選潛在(zai)(zai)的標志物種(zhong)(zhong)。PCA和OPLS-DA的樣(yang)本(ben)排序圖與PCoA類似，也(ye)是觀察樣(yang)本(ben)在(zai)(zai)坐(zuo)標軸(zhou)上(shang)的投(tou)影(ying)，樣(yang)本(ben)（組(zu)）間投(tou)影(ying)越(yue)遠，則兩樣(yang)本(ben)（或(huo)分組(zu)）在(zai)(zai)該(gai)坐(zuo)標軸(zhou)上(shang)的差異越(yue)大。
與(yu)PCoA不同的(de)(de)是(shi)，PCA與(yu)OPLS-DA還提供了物種載荷圖(tu)(tu)(tu)，點(dian)擊右上(shang)(shang)角圖(tu)(tu)(tu)表切(qie)換(huan)即可獲得。物種載荷圖(tu)(tu)(tu)可用于(yu)尋(xun)找標(biao)(biao)志物種。圖(tu)(tu)(tu)中(zhong)，每個點(dian)代(dai)表一個物種（默(mo)認為屬），點(dian)的(de)(de)橫坐(zuo)標(biao)(biao)和縱(zong)坐(zuo)標(biao)(biao)為該(gai)物種的(de)(de)VIP值(zhi)（Variable importance in projection），可分別認為是(shi)該(gai)物種對(dui)樣本(ben)在(zai)這(zhe)兩(liang)個維度上(shang)(shang)組(zu)間差異(yi)的(de)(de)貢(gong)獻大(da)小；兩(liang)個坐(zuo)標(biao)(biao)軸括號中(zhong)的(de)(de)百分數分別為所有樣本(ben)在(zai)該(gai)維度上(shang)(shang)的(de)(de)組(zu)間豐度差異(yi)占總的(de)(de)組(zu)間差異(yi)的(de)(de)比值(zhi)。橫縱(zong)坐(zuo)標(biao)(biao)軸的(de)(de)絕對(dui)值(zhi)越大(da)的(de)(de)物種越關(guan)鍵(jian)，可關(guan)注。
除了上述(shu)標志物(wu)種的分析篩選方(fang)法，我們還(huan)可以使用LEfSe和MetagenomeSeq這(zhe)兩大(da)神器來進行分析，具體方(fang)法，我們會在下次小課堂帶來講解哦~敬(jing)請關注！
我(wo)們也衷心歡迎大家進(jin)入基(ji)因云（//www.genescloud.cn/）嘗試使(shi)用，也可關注我(wo)們已經上線(xian)的網絡直播系列(lie)課程，每(mei)周四下午15:00不見不散(san)，大家一起在線(xian)互動交流哦！
