2021-05-28
1. 單細胞(bao)測序數(shu)據格式
通常(chang)使用illumina的(de)(de)(de)NovaSeq/Xten對(dui)10x單細胞平臺(tai)構建的(de)(de)(de)文(wen)(wen)庫進(jin)行(xing)測序。得(de)到的(de)(de)(de)BCL經過bcl2fastq或者cellranger mkfastq處(chu)理成常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)FASTQ格(ge)式的(de)(de)(de)文(wen)(wen)件(jian)(jian)。Bcl2fastq得(de)到的(de)(de)(de)就(jiu)是(shi)常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)下機數據文(wen)(wen)件(jian)(jian)，一般有兩(liang)個文(wen)(wen)件(jian)(jian)分(fen)別對(dui)應Read1和(he)Read2。Cellranger mkfastq本質上(shang)就(jiu)是(shi)對(dui)bcl2fastq進(jin)行(xing)的(de)(de)(de)封裝(zhuang)，除(chu)了(le)Read1和(he)Read2兩(liang)個文(wen)(wen)件(jian)(jian)，還(huan)會多一個Index文(wen)(wen)件(jian)(jian)（存放的(de)(de)(de)拆分(fen)文(wen)(wen)庫用的(de)(de)(de)index信息(xi)，沒有也不影響后(hou)續(xu)的(de)(de)(de)表達定量(liang)）。FASTQ文(wen)(wen)件(jian)(jian)命(ming)名(ming)格(ge)式為[Sample Name]_S1_L00[Lane Number]_[R1|R2|I1]_001.fastq.gz。比如(ru)下面這樣：
如果拿到的(de)測序結果不(bu)是(shi)以這種格(ge)式命名的(de)，需要先進行重(zhong)命名，不(bu)然cellranger會識別不(bu)到樣品對應的(de)文件！
2. 表達定量
cellranger count是10x官方(fang)的(de)表達定(ding)量流程(cheng)，可以(yi)對(dui)FASTQ數(shu)據進行(xing)(xing)基(ji)因組比對(dui)，barcode和UMI計(ji)數(shu)，生成feature-barcode表達矩陣，對(dui)識(shi)別到(dao)的(de)細胞進行(xing)(xing)聚類分群(qun)，并(bing)進行(xing)(xing)表達分析。cellranger count用法如下：
--id指(zhi)定樣品(pin)名，分析結果會保(bao)存在同名的文(wen)件夾中；
--transcriptome指定需要使用的參(can)考基因組(zu)；
--fastqs指定了FASTQ文件的(de)存放位(wei)置(zhi)；
--sample指(zhi)定了FASTQ文(wen)件中(zhong)的樣品名。
cellranger count需要的資(zi)源較多(duo)，建議在大型(xing)工(gong)作站或(huo)者服務器等配置較高的機器上運行(xing)。以(yi)150G數據量(liang)的人單細胞(bao)樣品為(wei)例，使用28個(ge)線程，內存約40G，總耗長約4h。看到如下信(xin)息就表示運行(xing)順(shun)利完成啦！
3. 結果說明
cellranger count運行過程(cheng)中(zhong)會生成以樣品命名(ming)的文(wen)件夾，分(fen)析結果保存在下(xia)一級(ji)的子(zi)文(wen)件夾outs。
各個文(wen)件/文(wen)件夾說明如下(xia)：
web_summary.html里(li)列出了常用的質控(kong)信息(xi)，包(bao)括：測序數據量、Q30、細(xi)胞數、基因組比(bi)對率等：
analysis文件夾保(bao)存了(le)cellranger分析的細胞聚類和表達分析的結果。
cloupe.cloupe文件可(ke)以(yi)導入到10x官方軟件Loupe Browser進行(xing)可(ke)視化分析filtered_feature_bc_matrix文件夾(jia)保存了分析得到的表達矩陣(zhen)。
以上就是cellranger進(jin)行表達(da)定(ding)量分(fen)析的介紹(shao)啦，分(fen)析得到的表達(da)矩陣文件可以導入到常見的第三方分(fen)析軟件（Seurat，scanpy等）進(jin)行進(jin)一(yi)步(bu)的分(fen)析，后(hou)續(xu)我(wo)們(men)會(hui)一(yi)一(yi)分(fen)享哦！
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