2021-06-10
生(sheng)物(wu)體(ti)正常的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)理功能依賴于(yu)復(fu)雜的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)及分(fen)子通過復(fu)雜的(de)(de)(de)(de)(de)網絡(luo)相互作用推進和(he)完成，生(sheng)物(wu)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)雜程度(du)在(zai)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)比例、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)空間(jian)位置(zhi)、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)基因表達、細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)通訊互作、染色質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)狀態、基因的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列等(deng)眾多(duo)(duo)維度(du)實現(xian)精準調控。單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)作為新出(chu)現(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)強(qiang)有(you)力工具，正是解(jie)析細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)網絡(luo)的(de)(de)(de)(de)(de)合(he)適技術(shu)手段(duan)，它通過一次(ci)性對(dui)數以萬(wan)計的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行檢(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)，繪制出(chu)組(zu)(zu)(zu)織或器官的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)圖譜，明(ming)確(que)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)調控模式和(he)狀態變化，為解(jie)析生(sheng)命機(ji)制提供細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)層次(ci)分(fen)辨(bian)率的(de)(de)(de)(de)(de)系(xi)統見(jian)解(jie)。隨(sui)著對(dui)科學研究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)不斷深入，單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)（ScRNA-seq）的(de)(de)(de)(de)(de)帝國包含了單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)(zu)(zu)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)，空間(jian)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)(zu)(zu)測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)、單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)ATAC測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)和(he)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)免疫組(zu)(zu)(zu)等(deng)幾(ji)個重量級產品(pin)，在(zai)不同水平揭示了組(zu)(zu)(zu)織內(nei)部的(de)(de)(de)(de)(de)異質(zhi)性。近期，有(you)越來越多(duo)(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)者(zhe)關(guan)注了單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)（SnRNA-seq）。相較于(yu)ScRNA-seq的(de)(de)(de)(de)(de)針對(dui)單(dan)(dan)個細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)，SnRNA-seq制備(bei)單(dan)(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核懸液(ye)，針對(dui)單(dan)(dan)個細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核進行測(ce)(ce)(ce)(ce)序(xu)和(he)分(fen)析。今天，小編(bian)為大家詳(xiang)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)比較以下兩者(zhe)的(de)(de)(de)(de)(de)優劣勢(shi)，看看兩者(zhe)更適用于(yu)怎樣的(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)場景(jing)。
ScRNA-seq的局限
1、 僅適用于新鮮組織樣本
影響ScRNA-seq結果的(de)關鍵(jian)因(yin)素是單細(xi)(xi)胞懸(xuan)(xuan)液的(de)質(zhi)量，ScRNA-seq對細(xi)(xi)胞懸(xuan)(xuan)液的(de)質(zhi)量要求非常高(gao)（細(xi)(xi)胞數(shu)量、活性(xing)、濃度、背景(jing)干擾等），因(yin)此細(xi)(xi)胞懸(xuan)(xuan)液的(de)制(zhi)備只適用于新鮮(xian)組(zu)(zu)織(zhi)或(huo)者凍(dong)存(cun)后復蘇組(zu)(zu)織(zhi)（主要是前者），這限(xian)制(zhi)了ScRNA-seq的(de)應用范圍(wei)，意味著保存(cun)在超低溫冰(bing)箱(xiang)中、具有(you)重要科(ke)研和臨床價值(zhi)的(de)大量珍貴樣本無(wu)法進行scRNA測序。
2、解離導致某些細胞類型的丟失
眾所周知，解離過程(cheng)中(zhong)不(bu)同(tong)類型(xing)細胞(bao)(bao)在(zai)解離效率上存在(zai)差異，與免疫(yi)細胞(bao)(bao)相比，成纖維細胞(bao)(bao)和(he)內皮(pi)細胞(bao)(bao)更多嵌于細胞(bao)(bao)外(wai)基(ji)質和(he)基(ji)底膜中(zhong)，因(yin)(yin)此更難以分(fen)解【2】；同(tong)時一些(xie)較為敏感的細胞(bao)(bao)可能會因(yin)(yin)為解離過度而破碎，因(yin)(yin)此解離過程(cheng)大(da)概率無(wu)法有效的獲取到(dao)組織中(zhong)的所有細胞(bao)(bao)類型(xing)，導致結果的準(zhun)確性大(da)為降低。
3、不適用于含大細胞的樣本類型
部分樣本類型，例如(ru)心(xin)臟、肌(ji)(ji)(ji)肉(rou)、脂(zhi)肪(fang)組織含有直徑較(jiao)大(da)的(de)心(xin)肌(ji)(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、骨骼肌(ji)(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和成熟的(de)脂(zhi)肪(fang)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，這些細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)共(gong)同點均是(shi)“大(da)”，例如(ru)心(xin)臟中(zhong)大(da)的(de)心(xin)肌(ji)(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，長(chang)和寬分別能(neng)達到(dao)100μm/25μm，而目前商(shang)業化(hua)的(de)單細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)平臺(tai)對(dui)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)大(da)小均有限制，以10X Genomics平臺(tai)為(wei)例，其(qi)芯(xin)片中(zhong)微管道直徑為(wei)50μm，建議捕(bu)獲的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)不(bu)要超過(guo)(guo)40μm，因此上機(ji)捕(bu)獲前需要經過(guo)(guo)30-40μm細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)篩過(guo)(guo)濾去除大(da)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)。如(ru)果研究的(de)樣本類型為(wei)心(xin)臟、脂(zhi)肪(fang)等且關注心(xin)肌(ji)(ji)(ji)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、脂(zhi)肪(fang)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)信(xin)息，ScRNA-seq就(jiu)不(bu)再是(shi)一個合(he)適(shi)的(de)選(xuan)擇。
基于以上列(lie)出的ScRNA-seq的局限性(xing)，SnRNA-seq開始在一(yi)些研究中被(bei)廣(guang)泛應用(yong)，以腦組(zu)(zu)織單細胞轉錄組(zu)(zu)研究為例，目前大多(duo)數(shu)文章更(geng)傾向于實用(yong)SnRNA-seq，包括神經細胞【3-5】、心臟(zang)【6、7】、腎臟(zang)【8、9】、肝臟(zang)【10、11】、脂肪【12、13】等。
SnRNA-seq的優勢
已經有大量文(wen)獻證明，SnRNA-seq能夠解決ScRNA-seq中存在(zai)的主要問題，其優勢(shi)主要體現(xian)如下：
1、適用樣本類型豐富(fu)，操作步驟(zou)相(xiang)對簡單
由于核膜穩定性比細胞膜高，因此組織凍存后細胞核膜不會被破壞，因此凍存組織可以提核做SnRNA-seq，提高了單細胞測序的樣本類型和實驗設計豐富度。
2、降低人為引入的轉錄偏差
因為組(zu)織可以直接從(cong)凍存狀態(tai)(tai)開始抽核，此(ci)狀態(tai)(tai)下細胞轉錄活動已經(jing)被抑制并(bing)固定，因此(ci)不會再發生轉錄狀態(tai)(tai)改變，結果真實性(xing)提高。
3、相對提高細胞類型的全面性
直接凍(dong)存(cun)狀態下對細胞進行(xing)機械(xie)破碎或者化學破碎，不(bu)會再出現(xian)酶解(jie)法引入的解(jie)離偏好性，相對而言細胞回(hui)收的全面性更高。通過比(bi)較(jiao)分析了腎臟(zang)組織(zhi)利(li)用(yong)dropseq和10x兩種平(ping)臺的ScRNA-seq和SnRNA-seq的區別，發(fa)現(xian)SnRNA-seq的結果中包含了很多(duo)在scRNA中不(bu)存(cun)在的細胞類型(xing)，腎小球足細胞的比(bi)例增加了20倍【14】。
SnRNA-seq的劣勢
雖(sui)然SnRNA-seq相比(bi)較ScRNA-seq具(ju)有多方面的優勢，但同樣SnRNA-seq的劣勢也(ye)比(bi)較明(ming)顯(xian)：
1、檢測到的基因少
SnRNA-seq只能檢測細(xi)胞(bao)(bao)核中的(de)mRNA, 缺失對細(xi)胞(bao)(bao)質中的(de)mRNA分子的(de)檢測。同(tong)時由于細(xi)胞(bao)(bao)核中帶(dai)有polyA尾的(de)成熟(shu)mRNA比例更低，因此對于某些樣本而言，采用SnRNA-seq每個細(xi)胞(bao)(bao)核中檢測到的(de)基因會偏少，不利于細(xi)胞(bao)(bao)亞型的(de)鑒定。
2、獲得免疫細胞較少
雖然上文提(ti)到SnRNA-seq可以提(ti)高(gao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)檢(jian)(jian)測的(de)全(quan)面性，但(dan)是其在(zai)某些(xie)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型的(de)再(zai)現上并沒有(you)優(you)勢(shi)。2020年發(fa)表在(zai)Nature Medicine的(de)一篇文章【15】，對不同(tong)腫瘤類(lei)型的(de)新鮮/冷凍樣本(ben)(ben)進行ScRNA-seq和SnRNA-seq， 結果(guo)顯示兩種(zhong)方(fang)法檢(jian)(jian)測到的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型相(xiang)似，但(dan)比(bi)例(li)差別較大：在(zai)神經母(mu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)瘤中， 相(xiang)比(bi)SnRNA-seq，ScRNA-Seq中免疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)比(bi)例(li)更高(gao)，神經嵴、神經內(nei)分(fen)泌細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)等實質(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)大幅(fu)減(jian)少(shao)；而SnRNA-Seq結果(guo)中實質(zhi)(zhi)性細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（尤其是惡(e)性細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)）比(bi)例(li)更高(gao)，但(dan)是T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)大幅(fu)減(jian)少(shao)，B細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和NK細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)基(ji)本(ben)(ben)消失，內(nei)皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、上皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)增(zeng)加(jia)。
總結
總體而言，若針對凍存樣本、細胞直徑大于40um以及相對較難解離的植物樣本，建議采用SnRNA-seq；一些較難解離的動物樣本，派森諾的單細胞研發團隊可提供一對一個性化的解離方案，讓科學研究多一種選擇。派森諾對肌肉、胰腺、骨骼等各類組織都擁有效果更佳的單細胞懸液制備經驗。某些具體情況，則要根據研究目的進行個性化地調整。例如，關注肝癌樣本中的肝實質細胞，SnRNA-seq是更佳的方案；關注肝癌樣本中的免疫細胞，ScRNA-seq是更加方案。若關注肝癌樣本中的肝實質細胞和免疫細胞，則可聯系您身邊的派森諾銷售，讓派森諾的資深技術支持，提供個性化的實驗方案。
參考文獻：
1、Defining cell types and states with single-cell genomics
2、Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations
3、A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain
4、Alzheimer's Patient Microglia Exhibit Enhanced Aging and Unique Transcriptional Activation
5、A Spatiomolecular Map of the Striatum
6、Cells of the adult human heart
7、Transcriptional heterogeneity of fibroblasts is a hallmark of the aging heart
8、A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys
9、Complementary Roles for Single-Nucleus and Single-Cell RNA Sequencing in Kidney Disease Research
10、Single-Nuclei RNA Sequencing Assessment of the Hepatic Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin
11、Characterizing the Heterogeneity of Liver Cell Populations Under a NASH-Related Hepatotoxicant Using Single-Nuclei RNA Sequencing
12、Plasticity of Epididymal Adipose Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolution
13、SnRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis
14、Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
15、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors
