2021-07-27
導語：又(you)是一周打工人的(de)開局，小編(bian)又(you)來啦(la)，來兌現上一專題說的(de)BSA定位后的(de)縮(suo)小候選區間(jian)&相關實驗(yan)內容整理喲~
縮小候(hou)選區間的(de)方法總結如下：
? 與遺傳圖譜(pu)結果相結合，基于(yu)表型數據(ju)，進行QTL定位，與BSA結果相結合；
? 開發SNP或者InDel分(fen)子(zi)標記(ji)，通過大(da)群(qun)體性狀(zhuang)與分(fen)子(zi)標記(ji)的共分(fen)離縮小候(hou)選(xuan)區間；
? 結合RNA-seq結果，選(xuan)取具有顯著差(cha)異表達的(de)或某顯著富集通路上的(de)基因(yin)(yin)作為候選(xuan)基因(yin)(yin)。
? 結合相關性狀(zhuang)的(de)文獻報告，基(ji)于序(xu)列同源(yuan)、基(ji)因的(de)功能或者相關突(tu)變(bian)類型（如EMS），鎖(suo)定候選(xuan)基(ji)因；
后續驗證方法總結有：
? 將候選標記轉化為CAPs（dCAPs）、凝膠電泳(yong)或(huo)者一代測(ce)序進行驗證；
? 基于RNA-seq的(de)差異(yi)(yi)表達分析，看基因是否有顯(xian)著表達差異(yi)(yi)；
? 轉基因(yin)驗證基因(yin)功(gong)能，如基因(yin)敲除，過表達、RNAi等；
? RT-PCR驗(yan)證候選(xuan)基因的表(biao)達模式。
? 蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)水平檢測基因表達(da)：選擇相(xiang)應的組織以(yi)WB等檢測目的蛋(dan)(dan)白(bai)的表達(da)。
先(xian)來(lai)一個(ge)科(ke)研人員關心的(de)內(nei)容吧—看(kan)看(kan)BSA具體發(fa)(fa)表的(de)文(wen)章，看(kan)到這(zhe)么多IF，是(shi)不是(shi)眼饞的(de)很，原來(lai)BSA小可(ke)愛(ai)也能發(fa)(fa)大(da)文(wen)章。下面我們一起捋捋，借(jie)鑒借(jie)鑒吧，也許下個(ge)高分文(wen)章就是(shi)你！
學習高分文章研究思路—做到開題心中有數：
1、如果你的傳統定位實驗由于標記缺失走不進去，請看這！
BSA定位黃瓜花和卷須形成的關鍵基因—CsUFO
本文基于實驗(yan)室的(de)圖位(wei)(wei)克隆(long)，定位(wei)(wei)到一(yi)(yi)個124kb候(hou)(hou)(hou)選(xuan)區間，內(nei)有21個候(hou)(hou)(hou)選(xuan)基因，逐一(yi)(yi)驗(yan)證工作量大，最主要周期長，常規定位(wei)(wei)走不(bu)進(jin)去(qu)，這時借助(zhu)BSA方法，和EMS誘變(bian)(bian)的(de)突變(bian)(bian)特點（即(ji)G:C變(bian)(bian)為A:T），在候(hou)(hou)(hou)選(xuan)區域內(nei)找到一(yi)(yi)個突變(bian)(bian)候(hou)(hou)(hou)選(xuan)位(wei)(wei)點，并成功驗(yan)證上。所以如果候(hou)(hou)(hou)選(xuan)區間無常規標記(ji)進(jin)一(yi)(yi)步(bu)縮(suo)小區間，不(bu)妨參考下此文，也許有不(bu)一(yi)(yi)樣(yang)的(de)收獲。
2、如果你的BSA結果候選區間比較大，請看這！
BSA定位四倍體棉花的葉色突變表型
BSA-seq分(fen)析(xi)方(fang)案(an)：
第一步：將v1突(tu)變體(ti)(ti)與野生(sheng)型(xing)(xing)雜交(jiao)構(gou)建(jian)BC1子代，根(gen)據(ju)突(tu)變體(ti)(ti)和(he)野生(sheng)型(xing)(xing)表型(xing)(xing)進行分離。
第二~五步：將(jiang)突(tu)變(bian)體親本T582株與28株突(tu)變(bian)體子代進行(xing)測序和BSA分析，定位在(zai)chr20:0.7~3.9cM內(nei)。
實驗室(shi)圖位克隆驗證：
第六步：將(jiang)T582與TM-1雜交產生F1代，F1自交得到2164個(ge)F2子代，其中(zhong)483個(ge)極端基(ji)于274個(ge)多態性SSR構建遺傳(chuan)圖(tu)譜，定位(wei)區(qu)間接近（驗證了BSA結果的(de)準確性）。
第七步：基于BSA測序中分析出的(de)T582與(yu)參考(kao)基因組間的(de)126541個InDel，篩(shai)選出候選區間內83個InDel，加密作圖標(biao)記進一(yi)步縮小到1.5cM。
第八步：基于另(ling)一個(ge)有2622個(ge)個(ge)體(ti)的作圖群體(ti)，最終精細(xi)定(ding)位到44kb內(nei)。
第九步：候選區間有8個ORF，比對TM-1和T582之間編碼區序列變異，找到ORF1和ORF4的一個外顯子各存在非同義突變SNP。對503個綠色F2個體進行連鎖分析。結果顯示只有ORF4中的SNP與v1基因座共分離。表明該SNP是T582中v1表型候選位點。
由本文工作內容可見，BSA直(zhi)接拿到基因固(gu)然可喜，但大多數情況(kuang)是(shi)區間(jian)很大，后續縮小(xiao)(xiao)區間(jian)的(de)工作量不容小(xiao)(xiao)覷(qu)（這(zhe)里(li)可以思考下，為什(shen)么(me)放大作圖群體呢？答(da)案關鍵詞當然就是(shi)重組(zu)交換事件啦）。
拿(na)到(dao)基因后(hou)續如何豐富(fu)文章內容，使故事更豐滿(man)呢？看(kan)一看(kan)高分文章的秘訣吧！
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