2021-08-11
ChIP-Seq相信很多老師已經很熟悉了，然而在做ChIP-Seq實驗時，甲醛交聯的效果，抗體的選擇，超聲的效果等因素都很大地影響了實驗的成功率，您是否也在為此苦惱呢？下面派森諾生物就帶大家了解一下ChIP-Seq的“升級版”- CUT&Tag，相較于傳統的ChIP-Seq， CUT&Tag將繁復的ChIP-Seq變成更為便捷簡單的操作，為研究DNA-蛋白質相互作用提供了更為有效的工具。
1.CUT&Tag 是什么？
CUT&Tag 是蛋白(bai)(bai)質-DNA 互作(zuo)關系研(yan)究(jiu)的(de)新方法(fa)，能在全基(ji)(ji)因組(zu)范圍內檢測與組(zu)蛋白(bai)(bai)、轉(zhuan)錄因子等互作(zuo)的(de)DNA片(pian)段(duan)，是新一代超(chao)微量ChIP-Seq技術(shu)，適(shi)用于無ChIP級別抗體的(de)蛋白(bai)(bai)研(yan)究(jiu)。CUT&Tag 有(you)望將(jiang)蛋白(bai)(bai)與染色質 DNA 互作(zuo)的(de)研(yan)究(jiu)變成了一種(zhong)類似(si) PCR 反應(ying)的(de)常(chang)規操(cao)作(zuo)，對基(ji)(ji)因調控、表觀遺傳等領域的(de)研(yan)究(jiu)具有(you)重(zhong)要(yao)的(de)意(yi)義。
2.CUT&Tag的流程？
① 收集細(xi)胞；
②分(fen)別孵育一抗(kang)和(he)二抗(kang)；
③孵育(yu)pA/pG-Tn5轉(zhuan)座子（HyperactivepA/pG-Tn5 Transposon）；
④激活(huo)轉座(zuo)子，進行(xing)DNA片段化；
⑤DNA提取；
⑥文庫擴(kuo)增(zeng)與純化。
3.CUT&Tag 技術的基本原理？
在(zai)抗(kang)體引導(dao)下，ChiTag 酶僅(jin)在(zai)目(mu)的(de)(de)組蛋白(bai)修飾標志、或轉錄因(yin)子、或染(ran)(ran)色質(zhi)調控蛋白(bai)結合染(ran)(ran)色質(zhi)的(de)(de)局(ju)部進(jin)行目(mu)的(de)(de) DNA 的(de)(de)片段(duan)化(hua)的(de)(de)同(tong)時添(tian)加測(ce)序接頭(tou)，并釋放到細(xi)胞(bao)外，而絕大部分無(wu)關(guan)的(de)(de)染(ran)(ran)色質(zhi)還留(liu)在(zai)細(xi)胞(bao)核內，因(yin)而整個實驗的(de)(de)信(xin)噪比大幅(fu)提高，同(tong)時簡化(hua)建庫操作，實現了(le)低細(xi)胞(bao)量樣本研(yan)究組蛋白(bai)修飾和(he)轉錄因(yin)子的(de)(de)目(mu)標。
4. CUT&Tag技術優勢？
①樣品起始量低
②無需提供ChIP級別抗體
③實驗操作簡便，周期短
④背景噪音低，信噪比高
⑤實驗重復性好
5. CUT&Tag適用于什么物種？
CUT&Tag適(shi)用(yong)于(yu)哺乳(ru)動(dong)物(wu)(wu)細(xi)胞(bao)(bao)的蛋白-DNA互作(zuo)研究，酵母、植物(wu)(wu)等細(xi)胞(bao)(bao)需要經(jing)過(破除細(xi)胞(bao)(bao)壁或者提取細(xi)胞(bao)(bao)核(he))來進(jin)行實(shi)驗。CUT&Tag在哺乳(ru)動(dong)物(wu)(wu)細(xi)胞(bao)(bao)系(xi)上的應用(yong)比較成熟(shu)，動(dong)物(wu)(wu)組織經(jing)過處理得(de)到懸浮(fu)單個細(xi)胞(bao)(bao)同(tong)樣可以進(jin)行實(shi)驗。
6. CUT&Tag的送樣要求？
樣本類型：細胞樣本(ben)、動物組(zu)織、DNA 文庫樣本(ben)
送樣(yang)要求：
細(xi)胞量：組(zu)蛋?≥40萬，轉錄因?≥100萬；復蘇(su)后(hou)細(xi)胞活率 ≥ 85% ；WB 2m
動物組織：轉(zhuan)錄(lu)因子(zi) ≥200mg；組蛋白 ≥100mg ；WB≥50mg
DNA文庫(ku)：總體積≥25ul，濃度≥2ng/ul，總量≥50ng，提供P7和P5的 index
7. 做CUT&Tag實驗的時候，陰性對照和陽性對照怎么設置，作用是什么?
與 ChIP 不同，該實驗(yan)方案不需要 input 樣本，但需要添加陰性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)和陽(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)。針對(dui)抗體的(de)陽(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)可以采(cai)用RNA Pol II/ 組蛋白(bai)，證明系統沒有問(wen)題。陰性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)使用與一(yi)抗相同種(zhong)屬的(de)IgG，陽(yang)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)，陰性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)證明抗體特異(yi)，實驗(yan)結果可信。
8. CUT&Tag 與 ChIP-Seq流程比較？
9. CUT&Tag和ChIP-seq，該如何選擇？
· 植物以外的物種，無(wu)論是(shi)組織(zhi)樣(yang)本還(huan)是(shi)細胞樣(yang)本，推薦CUT&Tag ，相對來說CUT&Tag具(ju)有(you)更高的成功率和信噪比；
· 植物樣本，推薦ChIP-seq。植物樣本提核困難，不(bu)適合CUT&Tag。
10. CUT&Tag技術應用？
· 應用于表觀遺(yi)傳學領域的蛋(dan)白質與DNA互作研究
· 研究(jiu)轉錄(lu)因(yin)子在(zai)全基因(yin)組(zu)上的結合或(huo)分(fen)布位點
· 研究(jiu)組(zu)(zu)蛋(dan)白修飾在全基因組(zu)(zu)上的分布位點
· 研究轉錄因(yin)子下游調(diao)控的靶基因(yin)
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