2021-08-27
單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)組學改變了(le)我們對于細(xi)(xi)(xi)胞(bao)異質性的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)與(yu)其動態重構的(de)(de)(de)(de)理解(jie)。多(duo)種(zhong)降(jiang)維(wei)、分(fen)(fen)群(qun)(qun)方法的(de)(de)(de)(de)開發可(ke)以讓我們迅速的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)辨(bian)出不(bu)同的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)類群(qun)(qun)。隨著研(yan)究(jiu)(jiu)轉向對復雜的(de)(de)(de)(de)人體組織甚(shen)至整個(ge)生物體的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)析，通過大(da)規模(mo)的(de)(de)(de)(de)高并行集群(qun)(qun)運算(suan)可(ke)以揭示罕見和(he)動態的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)狀態。目(mu)前，隨著技術(shu)的(de)(de)(de)(de)成(cheng)熟，市場上諸如10xgenomics、BD等平臺的(de)(de)(de)(de)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)產品在多(duo)個(ge)物種(zhong)中(zhong)都獲得(de)了(le)應用。但是(shi)，對于機構或(huo)者研(yan)究(jiu)(jiu)組織來說，想(xiang)完成(cheng)大(da)規模(mo)的(de)(de)(de)(de)圖譜或(huo)者隊列研(yan)究(jiu)(jiu)，單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)價格是(shi)十(shi)分(fen)(fen)昂貴的(de)(de)(de)(de)。獲得(de)一個(ge)低成(cheng)本的(de)(de)(de)(de)解(jie)決方案，是(shi)非常重要的(de)(de)(de)(de)。
此(ci)外，一(yi)些(xie)結(jie)構微小的(de)組(zu)織，如胚胎發(fa)育過程(cheng)中的(de)各(ge)個器官，消化后細胞(bao)(bao)總量少，單個樣(yang)本無(wu)法達到上機細胞(bao)(bao)數量要(yao)求，而因各(ge)方(fang)(fang)面原因需要(yao)區別不同樣(yang)本來(lai)源，傳統的(de)單細胞(bao)(bao)測(ce)序方(fang)(fang)案無(wu)法解(jie)決(jue)此(ci)問(wen)題。2021年(nian)cell發(fa)表了《Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution》一(yi)文，研究人(ren)員(yuan)利用單細胞(bao)(bao)RNA測(ce)序和(he)空間轉錄組(zu)學來(lai)表征隨時間變化的(de)腸道(dao)形態發(fa)生過程(cheng)。該文給低起始(shi)量樣(yang)本提供(gong)了新的(de)解(jie)決(jue)方(fang)(fang)案。
今天我們給大家介紹一種Cell Hashing的技術。
解釋Cell Hashing之前，大家不(bu)妨回(hui)憶一下CITE-seq這項技術(shu)，全(quan)稱為(wei)cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing，該技術(shu)可以(yi)同(tong)時(shi)對細(xi)(xi)胞(bao)內RNA和細(xi)(xi)胞(bao)表面(mian)蛋白進行(xing)測(ce)序。基于此，Cell Hashing是(shi)在CITE-seq的(de)基礎上改進，不(bu)過它的(de)應用不(bu)止于此，通(tong)(tong)過給通(tong)(tong)用的(de)普適抗體加(jia)上HTO (A distinct Hashtag oligonucleotide) 標簽，提前與樣(yang)本(ben)(ben)細(xi)(xi)胞(bao)進行(xing)孵育(yu)，之后(hou)將不(bu)同(tong)樣(yang)本(ben)(ben)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)進行(xing)混(hun)樣(yang)測(ce)序。Cell Hashing實現了可以(yi)一次上機，完成多個樣(yang)本(ben)(ben)的(de)測(ce)序工作(zuo)。
圖1：Cell Hashing測序原理
效果評估
根(gen)據Marlon Stoeckius（Genome Biol. 2018 Dec 19;19(1):224）等(deng)人的研究發現，Cell Hashing可以根(gen)據HTO在不(bu)同樣本(ben)間清(qing)晰(xi)的分出來，并且，對于多細(xi)胞(bao)這種情(qing)況(kuang)也(ye)有很好的辨別(bie)作用。下圖中可以清(qing)晰(xi)的看出HTO在不(bu)同樣本(ben)的barcode中十分特異，雖然會存在少量(liang)的混雜情(qing)況(kuang)，但是可以通(tong)過技術手(shou)段(duan)識(shi)別(bie)并且消除影響。
左圖：Barcode中HTOA和HTOB的數量的散點圖
右圖：熱圖展示(shi)不同樣本里(li)標準(zhun)化后的HTO值。
接下來，作者對數據進(jin)行了進(jin)一步(bu)分析，來評估準確(que)性(xing)。作者通(tong)過TSNE降維后發(fa)現，八(ba)個(ge)混樣(yang)(yang)樣(yang)(yang)本被(bei)清晰的分出(chu)，但是也伴隨著28個(ge)兩(liang)(liang)兩(liang)(liang)樣(yang)(yang)本混合(he)的類群。
通過(guo)對于(yu)樣本(ben)去批次效應，以及亞群(qun)注(zhu)釋揭(jie)示了(le)不(bu)(bu)同的免疫細(xi)胞(bao)群(qun)分布在不(bu)(bu)同的樣本(ben)之(zhi)間。其中包括了(le)B細(xi)胞(bao)、T細(xi)胞(bao)、NK細(xi)胞(bao)、樹突細(xi)胞(bao)、單核細(xi)胞(bao)等
作者(zhe)介紹到(dao)這(zhe)種(zhong)多(duo)路復用(yong)策(ce)略不僅可以對多(duo)個供體進(jin)行混出(chu)，而且還可以同時(shi)分(fen)析多(duo)種(zhong)實驗條件。另外一(yi)個優勢是在(zai)Barcode中可以根據單(dan)個HTO的清晰表達來區分(fen)單(dan)細(xi)胞和雙細(xi)胞，同時(shi)也(ye)可以用(yong)來區分(fen)低質量的細(xi)胞和環境RNA，這(zhe)種(zhong)方法比通(tong)過(guo)對UMI進(jin)行閾值限(xian)定(ding)這(zhe)種(zhong)硬性方式更(geng)加的有效。
實測分析
在了解(jie)到銷售同(tong)事的反饋(kui)有(you)相(xiang)關的老師需求之后，我們(men)分析端同(tong)事進行了實際(ji)測試。
我們(men)選擇(ze)了(le)二混一(yi)(yi)的(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)數據進行分(fen)析(xi)（實際中可以選擇(ze)更(geng)多(duo)樣(yang)本(ben)(ben)混合）。基于(yu)新版的(de)(de)CellRanger 中的(de)(de)multi模塊(kuai)，我們(men)成功的(de)(de)對樣(yang)本(ben)(ben)進行了(le)比對與定量工(gong)作(zuo)，并且(qie)(qie)相較于(yu)常規(gui)的(de)(de)單(dan)細胞轉錄組，其還會額外生(sheng)成一(yi)(yi)個barcode與HTO的(de)(de)矩陣。我們(men)發現，在(zai)二混一(yi)(yi)的(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)中，樣(yang)本(ben)(ben)細胞得到了(le)有效的(de)(de)鑒(jian)定與分(fen)離，且(qie)(qie)常規(gui)指(zhi)標均滿(man)足分(fen)析(xi)需求。
圖4.1:單細胞測序結果
圖4.2:單細胞測序數據比對指標
并(bing)且我們基于(yu)這(zhe)兩個樣本完成了細胞(bao)鑒定，發現細胞(bao)類型及(ji)占比符合該(gai)組織在之前單細胞(bao)文獻(xian)中的報道。
圖4.3：細胞比例占比圖
圖4.4：細胞比例TSNE圖
總 結
對于有考慮在物種中做細胞圖譜(pu)或(huo)者想做大隊列研究的(de)(de)科(ke)研單位(wei)，使用(yong)多樣本混合建庫的(de)(de)方(fang)法可以保證數(shu)據的(de)(de)質量與結果的(de)(de)穩定(ding)性(xing)，也可以降低成本。
如果需要測試數據結果的老師，也可以后臺聯系我們。
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