2021-09-09
抗(kang)CTLA-4和(he)抗(kang)PD-1免疫(yi)(yi)療(liao)法(fa)對腫瘤的抑制(zhi)作用(yong)是多(duo)層面(mian)的，同時(shi)也(ye)會產生一定(ding)的副(fu)作用(yong)，例如結腸(chang)炎(yan)等(deng)，其分子機制(zhi)了解(jie)尚少。通過單(dan)細胞測序和(he)單(dan)細胞免疫(yi)(yi)組庫測序分析(xi)顯示，決定(ding)腫瘤免疫(yi)(yi)副(fu)作用(yong)的并不(bu)是Treg細胞，而是殺傷性T細胞和(he)增殖性T細胞。通過對這些(xie)細胞的基因表達等(deng)深入分析(xi)，篩選潛(qian)在的用(yong)于免疫(yi)(yi)治療(liao)副(fu)作用(yong)的治療(liao)靶點(dian)。
1、課題思路
2、免疫治療引起的結腸炎的免疫細胞分析
選取6例(li)(li)免疫治療(liao)引起結腸(chang)(chang)炎（case組），5例(li)(li)經免疫治療(liao)無結腸(chang)(chang)炎（無腸(chang)(chang)炎對照組）以(yi)及5例(li)(li)正常(chang)人（正常(chang)對照組）的(de)腸(chang)(chang)道(dao)組織(zhi)制備(bei)單細(xi)胞懸液(ye)，經CD45+分選，獲(huo)得了51652個細(xi)胞。對這些細(xi)胞的(de)分群結果顯示(shi)，case組的(de)殺(sha)傷性T細(xi)胞和增殖性T細(xi)胞的(de)細(xi)胞數目大大增加。
3、case組的殺傷性CD8T細胞和增殖性CD8T增多
隨后針對(dui)8例(li)case組(zu)，6例(li)無腸炎對(dui)照組(zu)，8例(li)正常對(dui)照組(zu)的(de)腸道組(zu)織制備單細(xi)胞(bao)(bao)懸液，經CD3+分選后進行(xing)單細(xi)胞(bao)(bao)5’轉錄組(zu)測序和單細(xi)胞(bao)(bao)TCR測序。結果顯示對(dui)照組(zu)的(de)CD4細(xi)胞(bao)(bao)和CD8細(xi)胞(bao)(bao)的(de)數目(mu)均增(zeng)加。
對CD8T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)分(fen)群可將其分(fen)成8個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞亞群，其中cytotoxic effector細(xi)(xi)(xi)(xi)胞和cyclingT細(xi)(xi)(xi)(xi)胞是case組特有(you)的(de)(de)，此(ci)外，central memory/na?veT細(xi)(xi)(xi)(xi)胞和terminal effectorT細(xi)(xi)(xi)(xi)胞是case組的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞數(shu)目大(da)于兩組control組，殺(sha)傷性效應分(fen)子(zi)GZMB的(de)(de)表達在上述三(san)類細(xi)(xi)(xi)(xi)胞里也是case組大(da)于兩組control組。這些細(xi)(xi)(xi)(xi)胞亞群，可能參與了免疫治療引發的(de)(de)結(jie)腸(chang)炎(yan)。相對應地，tissue-resident memoryT細(xi)(xi)(xi)(xi)胞在case組的(de)(de)數(shu)目小于兩組control組。以上結(jie)果(guo)經流式和多色免疫熒光驗證獲得了一致的(de)(de)結(jie)果(guo)。
4、case組的效應性細胞和調節性細胞增多
對CD4T細(xi)胞(bao)的細(xi)分群可將其分成10個細(xi)胞(bao)亞(ya)群，其中(zhong)Th1 effector細(xi)胞(bao)和cycling T細(xi)胞(bao)是case特有的，tissue-resident memory T細(xi)胞(bao)是case數(shu)目(mu)更少的。
在動物模型中(zhong)的(de)(de)(de)研(yan)究顯示抗CTLA-4治(zhi)療(liao)(liao)減少了Treg的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)數(shu)(shu)目(mu)，因此，Treg的(de)(de)(de)數(shu)(shu)目(mu)減少可能(neng)是(shi)引(yin)起(qi)(qi)(qi)副作用的(de)(de)(de)一個原因。針對Treg的(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)數(shu)(shu)目(mu)統計發現，case組(zu)的(de)(de)(de)Treg細胞(bao)(bao)數(shu)(shu)目(mu)比兩組(zu)control略高，并且(qie)FOXP3的(de)(de)(de)表達量也是(shi)在case組(zu)略高，以上結果經流式驗證獲得了一致(zhi)的(de)(de)(de)結果。說明免疫治(zhi)療(liao)(liao)引(yin)起(qi)(qi)(qi)的(de)(de)(de)結腸(chang)炎并不是(shi)由(you)Treg細胞(bao)(bao)數(shu)(shu)目(mu)減少引(yin)起(qi)(qi)(qi)的(de)(de)(de)。
5、結腸炎相關的T細胞和組織駐留T細胞的TCR克隆型相同
篩選(xuan)到與結(jie)腸(chang)炎(yan)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)的(de)T細(xi)胞(bao)后，首先關(guan)(guan)注的(de)問(wen)題是(shi)這(zhe)類細(xi)胞(bao)起(qi)(qi)源于哪類細(xi)胞(bao)。通過(guo)TCR克(ke)隆(long)型的(de)分(fen)析顯示，結(jie)腸(chang)炎(yan)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)的(de)T細(xi)胞(bao)的(de)克(ke)隆(long)型與tissue resident T細(xi)胞(bao)的(de)克(ke)隆(long)型高度(du)相(xiang)(xiang)同，并且擬時序(xu)分(fen)析結(jie)果顯示tissue resident T細(xi)胞(bao)是(shi)結(jie)腸(chang)炎(yan)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)T細(xi)胞(bao)的(de)起(qi)(qi)源。
6、T細胞的免疫逃逸相關基因表達分析
作者隨后(hou)針對所有(you)CD8T細(xi)(xi)胞和CD4T細(xi)(xi)胞分析了免疫逃逸相(xiang)關基因的表(biao)達情況。結(jie)(jie)果顯示，在結(jie)(jie)腸炎相(xiang)關的T細(xi)(xi)胞中，免疫逃逸基因表(biao)達均(jun)大(da)(da)大(da)(da)提高。而結(jie)(jie)腸炎相(xiang)關的T細(xi)(xi)胞相(xiang)較于其它T細(xi)(xi)胞，GZMB，GNLY等細(xi)(xi)胞殺傷(shang)性因子以(yi)及(ji)干(gan)擾素(su)反應大(da)(da)大(da)(da)增加。
7、髓系細胞炎性基因表達
作者針(zhen)對CD45+細(xi)胞(bao)(bao)進(jin)行了(le)驗證碼基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)表(biao)達(da)，結(jie)果顯示髓(sui)系細(xi)胞(bao)(bao)中高表(biao)達(da)了(le)IFNγ和TNFα相(xiang)關的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達(da)大大增(zeng)加(jia)。其(qi)中case組最(zui)高表(biao)達(da)的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)是(shi)CXCL10和CXCL9。將髓(sui)系細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)細(xi)分群可(ke)分成(cheng)3個巨噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)/單核細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)(ya)群，1個DC細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)(ya)群以及一類(lei)吞噬(shi)了(le)T細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)(ya)群。Case組的(de)(de)亞(ya)(ya)群1類(lei)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)數目增(zeng)多，這類(lei)細(xi)胞(bao)(bao)高表(biao)達(da)了(le)CXCL9和CXCL10以及高表(biao)達(da)了(le)IFNγ和TNFα相(xiang)關基(ji)因(yin)(yin)。
8、篩選T細胞和髓系細胞相關的潛在治療靶點
鑒于免疫治(zhi)(zhi)療(liao)引起的結腸(chang)炎具有T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)增(zeng)多和(he)(he)炎癥(zheng)反應增(zeng)加，針對T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)招募和(he)(he)炎癥(zheng)反應，可以篩選潛(qian)在(zai)的治(zhi)(zhi)療(liao)靶點。CXCR3和(he)(he)CXCR6在(zai)case組(zu)的T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)高(gao)表(biao)達，兩者的ligand CXCL16在(zai)髓系(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)肥(fei)大細(xi)(xi)胞(bao)(bao)高(gao)表(biao)達，CXCL9和(he)(he)CXCL10在(zai)髓系(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)高(gao)表(biao)達，暗(an)示(shi)髓系(xi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的通訊在(zai)免疫治(zhi)(zhi)療(liao)引發(fa)的結腸(chang)炎中(zhong)發(fa)揮重要功能。
整(zheng)合素蛋(dan)白α4β7參(can)與腸(chang)道對血液(ye)的(de)T細(xi)胞的(de)招募，其(qi)編碼基因ITGA4在結腸(chang)炎相關(guan)的(de)CD4T細(xi)胞和CD8T細(xi)胞里高表(biao)達，靶向整(zheng)合素的(de)藥物(wu)可能對免(mian)疫治療引起(qi)的(de)結腸(chang)炎有一(yi)定的(de)療效(xiao)。
此外(wai)，針對(dui)一系(xi)列炎癥因子基因的(de)表(biao)達(da)分(fen)(fen)析顯示，在(zai)(zai)case組(zu)的(de)髓系(xi)細胞(bao)高表(biao)達(da)的(de)基因包(bao)括TNF、IL1B等，在(zai)(zai)case組(zu)的(de)T細胞(bao)里(li)高表(biao)達(da)了TNFRSF11A。前期臨床(chuang)試(shi)驗顯示TNFα抑制劑對(dui)免(mian)疫(yi)治療(liao)引(yin)發的(de)結腸炎有一定(ding)的(de)療(liao)效。NLRP3可以(yi)促進IL1分(fen)(fen)泌，單細胞(bao)測序結果顯示兩者(zhe)信號(hao)通(tong)路(lu)高度共表(biao)達(da)，NLRP3是(shi)(shi)在(zai)(zai)case組(zu)表(biao)達(da)大(da)大(da)提高。抗IL-1β單抗可能是(shi)(shi)免(mian)疫(yi)治療(liao)引(yin)發的(de)結腸炎的(de)潛(qian)在(zai)(zai)藥物。
結論
通過該研究鑒(jian)定到了免疫(yi)治(zhi)(zhi)療引(yin)發的結腸炎的關鍵(jian)細胞亞群(qun)，解析了免疫(yi)治(zhi)(zhi)療副作用的細胞水(shui)平(ping)和分子水(shui)平(ping)的機制。為后續的治(zhi)(zhi)療鑒(jian)定了潛在的治(zhi)(zhi)療靶點。
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