2017-07-21
2017年6月22日，派森諾生物與中國科學院動物研究所趙建國研究員團隊合作，在高水平期刊《eLife》（影響因子7.725）上發表最新研究成果，成功建立了豬的化學誘變體系，開展了大規模的豬ENU化學誘變和突變體篩選研究。
研究背景
豬作為一(yi)種(zhong)重(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)家畜(chu)，既是(shi)(shi)人類主要(yao)的(de)(de)(de)肉食來(lai)源，同時也是(shi)(shi)生物(wu)(wu)醫學研究(jiu)中(zhong)不可或(huo)缺(que)的(de)(de)(de)模(mo)式大(da)動物(wu)(wu)。對豬功能(neng)基因認識的(de)(de)(de)有(you)限性(xing)，阻礙了(le)豬經(jing)濟性(xing)狀(zhuang)遺傳改良的(de)(de)(de)發展(zhan)，以(yi)及創(chuang)(chuang)制人類遺傳疾(ji)病的(de)(de)(de)大(da)動物(wu)(wu)模(mo)型(xing)。人工誘變是(shi)(shi)發現(xian)(xian)新功能(neng)基因的(de)(de)(de)一(yi)種(zhong)有(you)效途徑，過去在(zai)線蟲、果(guo)蠅、斑(ban)馬魚和(he)小鼠等動物(wu)(wu)中(zhong)的(de)(de)(de)研究(jiu)已取得了(le)重(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)研究(jiu)成果(guo)，但在(zai)大(da)型(xing)哺乳(ru)動物(wu)(wu)的(de)(de)(de)研究(jiu)中(zhong)尚是(shi)(shi)空(kong)白。ENU(N-乙基-N-亞(ya)硝基脲(niao))是(shi)(shi)一(yi)種(zhong)化學誘變劑，能(neng)夠在(zai)基因組中(zhong)隨機誘導點突變或(huo)染色體重(zhong)排，從而實現(xian)(xian)規模(mo)化創(chuang)(chuang)制突變體和(he)挖掘新基因。
本(ben)研(yan)究首次驗證了ENU突(tu)變(bian)(bian)應用于(yu)大(da)型(xing)動物的(de)可(ke)行(xing)性(xing)。通過對6770頭G1代和(he)6800頭G3代誘變(bian)(bian)群體進行(xing)大(da)規模(mo)的(de)篩(shai)選，成(cheng)功獲得36個顯性(xing)遺傳(chuan)突(tu)變(bian)(bian)體和(he)91個隱性(xing)遺傳(chuan)突(tu)變(bian)(bian)體，建立(li)了多(duo)個能準確模(mo)擬(ni)人類疾(ji)病的(de)大(da)動物模(mo)型(xing)和(he)可(ke)用于(yu)豬新品系培育的(de)育種(zhong)新材料。
研究方法(fa)
對(dui)10個G1代采用簡化基因(yin)組(zu)測序方法研究(jiu)ENU引(yin)起的基因(yin)組(zu)突變(bian)；對(dui)2個突變(bian)型和一個野生型采用全基因(yin)組(zu)重測序定(ding)位內耳畸形基因(yin)，測序深度分別為(wei)11.51x，10.64x 和10.63x。
研究結果
1. 巴馬豬的ENU突變
對ENU在(zai)巴馬豬的(de)全基(ji)因組水平引起的(de)突(tu)(tu)變頻率(lv)進(jin)行(xing)研(yan)究，發現經(jing)ENU處理產生(sheng)的(de)主要變異形式為堿(jian)基(ji)轉換和顛換，其(qi)中(zhong)堿(jian)基(ji)轉換頻率(lv)（71.2%）顯著(zhu)高于(yu)顛換（28.8%）。經(jing)統(tong)計(ji)，平均每個(ge)GI代攜帶4500-16,458個(ge)雜合突(tu)(tu)變，并(bing)且(qie)大多數位(wei)于(yu)基(ji)因間(jian)隔區。此外(wai)，通(tong)過對ENU的(de)誘變劑量(liang)進(jin)行(xing)考察，得(de)出能(neng)引起有效突(tu)(tu)變的(de)合適劑量(liang)為3×85 mg/kg ENU。
2. 顯性突(tu)變體和(he)隱性突(tu)變體的表型篩選(xuan)
通過三代(dai)遺傳家系組建篩選顯性突(tu)(tu)(tu)變體(ti)和(he)隱(yin)(yin)性突(tu)(tu)(tu)變體(ti)，對巴馬豬的生(sheng)(sheng)長(chang)性狀、出生(sheng)(sheng)缺陷、血液生(sheng)(sheng)理生(sheng)(sheng)化、行為(wei)等指標進行表(biao)型(xing)篩選，在6770頭G1代(dai)和(he)6800頭G3代(dai)誘變群體(ti)中共獲得36個(ge)顯性遺傳突(tu)(tu)(tu)變體(ti)和(he)91個(ge)隱(yin)(yin)性遺傳突(tu)(tu)(tu)變體(ti)。這些突(tu)(tu)(tu)變體(ti)表(biao)型(xing)各異，具體(ti)表(biao)現為(wei)聽(ting)覺(jue)受損、骨骼(ge)缺陷、后肢癱瘓、膚色變異和(he)體(ti)型(xing)變化等。
3. SOX10基因突變可(ke)導致(zhi)豬的內(nei)耳畸形且(qie)可(ke)作為人Mondini內(nei)耳畸形疾病的研(yan)究(jiu)模型
研究發現突變體TBB007T095聽覺嚴重受損，與人Mondini內耳畸形疾病病理表型高度相似。通過GWLS分析在5號染色體（7-71 Mb）上發現一個顯著的遺傳連鎖區域，并在該區域中分離到了色素衰退相關基因SOX10，該內耳畸形突變體的致病位點被精確定位為SOX10基因第109位氨基酸的改變 (R109W)。推測SOX10基因可能是Mondini內耳畸形的致病基因，且該突變體可作為人Mondini內耳畸形疾病的首個大動物模型。
4. FBXO32基因上(shang)調與(yu)豬的后(hou)肢癱(tan)瘓(huan)有關
先天性后肢癱瘓是幼豬殘疾的主要原因，在所有后肢癱瘓突變體中，骨骼肌萎縮相關基因—FBXO32高度表達。通過遺傳圖譜分析，在4號染色體16-17Mb區域內發現了強烈的關聯信號，且FBXO32就存在于該區域中，FBXO32的上調可能引起肌肉萎縮并導致后肢癱瘓。
總結
該研究首次通過ENU化(hua)學(xue)誘變(bian)人工加(jia)速(su)了(le)豬(zhu)內源基因發生突變(bian)的(de)(de)頻率(lv)，規模(mo)化(hua)制備了(le)大(da)動物(wu)的(de)(de)突變(bian)體，推動了(le)豬(zhu)作為模(mo)式大(da)動物(wu)的(de)(de)發展，為豬(zhu)的(de)(de)新品種培育和臨床(chuang)疾病大(da)動物(wu)模(mo)型的(de)(de)建(jian)立提供了(le)全新策(ce)略(lve)。
文章索引
Hai T, Cao C, Shang H, et al. A pilot study of large-scale production of mutant pigs by ENU mutagenesis. eLife, 2017, 6: e26248. DOI:10.7554/eLife.26248
