2021-10-27
m6A甲基化是轉錄后調控中重要的表觀遺傳修飾方式，它普遍存在于病毒和真核生物中。MeRIP-seq（高通量測序法）作為m6A修飾的檢測方法，其具有針對全基因組范圍內檢測m6A的存在；能夠明確每個基因的修飾水平，進行組與組之間比較等優勢。接下來就讓小編帶大家詳細了解m6A和MeRIP-seq。
轉錄后調(diao)控(post-transcriptional control)是指在(zai)轉錄后水(shui)平(RNA)上對基(ji)因表達(da)的調(diao)控，包括(kuo)對真核生物基(ji)因的轉錄產(chan)物進行的一系列修飾(shi)和加(jia)工。 轉錄后調控(kong)具體主要體現在： 1）對mRNA前體hnRNA的剪接和加工；例如5’-端加帽、3’-端polyA尾、RNA修(xiu)飾(shi)、RNA剪接。 2）mRNA由細胞核轉至(zhi)細胞質的過程及(ji)定(ding)位； 3）mRNA的穩定(ding)性、降(jiang)解、翻譯過程等多個環節進行的調(diao)控； 4）RNA編輯和RNA干(gan)擾(rao)等現象也屬于(yu)轉錄(lu)后調控。 2.什么是m6A？ m6A甲基化修飾是指腺嘌呤的6號碳原子連接的氨基基團中的一個氫被甲基基團取代，在m6A甲基化過程中涉及的這3類重要的酶： ①Writers，甲基化酶，催化m6A甲基化的發生； ②Erasers，去甲基化酶：去除m6A甲基化的修飾； ③Readers，m6A識別蛋白，識別m6A修飾位點。 如下圖所示，m6A是動態可逆的。 Dominissini, D. et al.（2014） 3. m6A具有哪些生物學功能，以及應用的領域？ m6A具有調控可變剪切、調控mRNA出核轉運、調控mRNA的選擇性翻譯和翻譯速率、相分離以及與RNA的穩定性有關等功能。 m6A作為最常見的一種轉錄后修飾，介導了超過80%的RNA甲基化。其調控機制與生物學功能涉及各個領域： 醫學： 1）癌癥：肺癌、肝癌、等，研究的主要內容包括m6A修飾如何影響腫瘤的發生、增殖、轉移、耐藥等； 2）其它類(lei)(lei)疾病：心(xin)血(xue)管疾病，神經性疾病，代謝類(lei)(lei)疾病等； 3）胚胎發育等(deng)。 農學(xue)： 研(yan)究的物種有果(guo)蠅(ying)，斑馬(ma)魚(yu)，豬；擬(ni)南(nan)芥、玉米，水稻，番(fan)茄等(deng)。 4. MeRIP-seq的實驗設計(ji)？ 實(shi)驗樣本： 細(xi)胞、組織、提取后的總 RNA（限定有參基(ji)因組物(wu)種）。 實(shi)驗分組： 細胞(bao)模型：實驗(yan)組(zu)VS對照組(zu)，建議3:3 組(zu)織模型：正常(chang)組(zu)VS疾病組(zu)，建議5:5 組(zu)內對(dui)照：IP組(zu)VS input組(zu)* 注*：input組(zu)主要用(yong)于(yu)比(bi)較鑒定IP組(zu)的抗體(ti)(ti)特異性結合，是必(bi)備的組(zu)分 測序(xu)平臺：NovaSeq 關(guan)鍵分(fen)析內容： m6A的基本特征 特征一. Peak在基因元件的分布 特征二(er). reads在基因(yin)元(yuan)件(jian)的(de)分布 特征三. Peak關聯(lian)基因的(de)特征 5. MeRIP-seq的送樣要(yao)求？ ? 樣本(ben)類型：細胞(bao)、組織、total RNA ? 樣本要(yao)求： ?人、大鼠、小鼠 常(chang)規(gui)MeRIP-seq：Dnase消化(hua)后RNA總(zong)量≥25μg，濃度≥100 ng/μg，RIN≥8； ?非人非鼠物種 Dnase消化后RNA總量≥150μg，濃度≥100 ng/μg，RIN≥8。 注： 1）人、小鼠和大鼠可同時檢測mRNA和lncRNA上的m6A修飾，非人非鼠物種（人、小鼠、大鼠以外的物種）只能檢測mRNA上的m6A修飾； 2）盡(jin)量提(ti)供RNA樣(yang)本； 3）如(ru)需(xu)公司(si)進(jin)行RNA提(ti)取，請根據(ju)樣本特性估算樣本量，最(zui)終獲得的RNA質量和總量以質檢結(jie)果為準； 4）活體(ti)取(qu)樣，剔除(chu)結(jie)締組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)以及其它(ta)非研究組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)，用預冷的(de)PBS漂洗(xi)，去(qu)除(chu)血液(ye)和雜質。體(ti)積較大的(de)組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)需切割成(cheng)綠豆大小(xiao)的(de)小(xiao)塊。將組(zu)(zu)(zu)織(zhi)(zhi)放(fang)入事先標記(ji)好樣本信息的(de)RNAase-free管(guan)中（管(guan)子速(su)凍后(hou)無(wu)法做標記(ji)），立即液(ye)氮速(su)凍2min，-80℃保存。 6. MeRIP-seq建庫測序流(liu)程？ MeRIP-seq技術包括MeRIP實驗和測序(xu)兩個部分。 流程圖如下圖所示(shi)： 每組MeRIP-seq由兩種類型的樣本組成，即immunoprecipitation（IP）樣本和Input對照樣本。RNA分子首先被片段化成約100-200nt的片段。通過抗m6A的特異性抗體，IP樣本提供了甲基化RNA片段的無偏測量。同時，Input對照樣本可反映基礎RNA的豐度。通過建庫、高通量測序和生物信息學分析，給出全轉錄組m6A的定位。 Fu, Y et al. (2014) 7. MeRIP-seq分析流(liu)程？ 測序數據下機之后，我們就可以(yi)獲得原始測序序列(lie)(Sequenced Reads)，在有相關物種參考序列(lie)或(huo)參考基因組(zu)的情況下，我們通過如(ru)下標準流程進行生物信息分析： 8. MeRIP-seq后續的實驗(yan)驗(yan)證？ MeRIP-qPCR：利用(yong)m6A抗體在富集(ji)到帶甲(jia)基化(hua)修飾的RNA后，下(xia)一(yi)步使用(yong)qPCR直接對(dui)富集(ji)到的RNA進(jin)行(xing)定量的一(yi)種技術。建議結合(he)基因表(biao)達(da)RT-qPCR 、WB等驗(yan)證手(shou)段一(yi)起進(jin)行(xing)試驗(yan)結果驗(yan)證。 9. m6A甲基化的研究思路？ 典型的m6A研究的法則： 1） m6A測序前的預實驗，檢測RNA的m6A水平是否發生差異等； 2） m6A測序及轉錄組學挖掘差異基因； 3） 后期功能驗證。 10. 相比其他m6A檢測方法，MeRIP-seq具有哪些優勢？ 1、針對全基因組范圍內檢測m6A的存在； 2、m6A的檢測結果檢測到基因水平； 3、能(neng)夠明(ming)確每個基因的(de)修(xiu)飾水(shui)平(ping)，進行組(zu)與組(zu)之間比較； 4、檢測平臺為(wei)測序儀(yi)(yi)，儀(yi)(yi)器(qi)限(xian)制低，通(tong)用性高，重(zhong)復性好； 5、結果可以和(he)其他組學(xue)聯合分(fen)析，從多維度講述機制機理故(gu)事； 6、實驗操作簡單，入門容易。
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