隨著10X、BD等(deng)平臺技術的推進，單細胞(bao)層面解析(xi)表達和開放染色質水平的研(yan)究方法已經得到很(hen)好的建立，并且在(zai)動植物種中都得到了很(hen)好的嘗試。

對于(yu)研究特(te)定組蛋白修飾或轉錄因子結(jie)合的(de)染色質區域(yu)的(de)單細(xi)胞(bao)分析在技術上具有挑戰性。今(jin)天小編和(he)大家分享一篇(pian)今(jin)年四月份發表于(yu)Nature Biotechnology 的(de)article 《Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues》。

這篇文章(zhang)使用調整了基于(yu)10x Genomics單細(xi)胞(bao)(bao) ATAC-seq平臺，開發并應用了單細(xi)胞(bao)(bao)Cut&Tag (scCUT&Tag)手段，以(yi)研究小鼠大腦中單細(xi)胞(bao)(bao)水平的(de)組(zu)蛋(dan)白修(xiu)飾譜。在之前(qian)的(de)研究中作者發現(xian)少突(tu)膠質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)譜系(xi) (OLG) 具有異質(zhi)性(xing)(xing)，并且(qie)能夠在發育和疾病(bing)期間(jian)轉變(bian)為替代細(xi)胞(bao)(bao)狀態。基于(yu)此，作者構建了組(zu)蛋(dan)白修(xiu)飾、染色質(zhi)結(jie)構因(yin)子和cohesin復(fu)合(he)(he)物RAD21的(de)亞基以(yi)及OLG特異性(xing)(xing)轉錄因(yin)子 (TF) OLIG2等非組(zu)蛋(dan)白的(de)單細(xi)胞(bao)(bao)層面的(de)結(jie)合(he)(he)譜。

技術路線 

為(wei)了(le)研(yan)究OLGs，作(zuo)者使用了(le)一個表達Sox10：Cre/Rosa26：(CAG-LSL-EGFP)小(xiao)鼠(RCE)的(de)小(xiao)鼠模型(xing)，該模型(xing)主要(yao)標記小(xiao)鼠中(zhong)樞神(shen)經系統(CNS)中(zhong)的(de)OLGs。作(zuo)者從P15和P25的(de)小(xiao)鼠大腦中(zhong)分(fen)離細胞(bao)，同時(shi)，作(zuo)者為(wei)了(le)更(geng)加明確OLGs的(de)分(fen)化，在P25時(shi)期做了(le)兩個重復，分(fen)別在少突膠(jiao)質(zhi)細胞(bao)分(fen)化的(de)高峰和髓鞘形成的(de)開始(shi)時(shi)，并(bing)分(fen)為(wei)GFP+和GFP?群(qun)體；分(fen)離細胞(bao)核并(bing)與抗(kang)染(ran)色質(zhi)修飾或TFs的(de)特異(yi)性抗(kang)體孵育，使用蛋白A-Tn5融(rong)合標記，用10x Genomics 的(de)scATAC-seq協議處理。

實驗技術路線

分析路線 

將scCUT&Tag信號整合成(cheng)一個細胞×bin的(de)矩(ju)陣，其中(zhong)，bin分成(cheng)不同的(de)大小(5kb或50kb)；使(shi)用LSI和(he)UMAP進(jin)行降維(wei)，并使(shi)用SNN進(jin)行聚類。使(shi)用細胞簇(cu)來(lai)識(shi)別(bie)標記區域，計算每個細胞的(de)基因活性評分，并與其他數據集進(jin)行整合。

分析路線

在開始正式分析之前為了驗證 scCUT&Tag 數據是否可用于分辨異質細胞群，作者制備了三種細胞系的混合物：小鼠胚胎干細胞（mESC，C57Bl/6J 來源）、小鼠胚胎成纖維細胞 (NIH-3T3) (ATCC) 和小鼠少突膠質祖細胞模型細胞系（Oli-neu）。然后使用10x Genomics Chromium 平臺對標記的細胞核進行條形碼標記，使用 v.1 (rep1) 和 v.1.1 (rep2) 10x Genomics scATAC–seq 試劑盒在兩個技術重復中針對 H3K27me3 組蛋白修飾進行 scCUT&Tag優化，具體可以參考文章中的方法。最終獲得了4,872和3,873個單細胞的H3K27me3 譜，每個細胞分別具有597和568個獨特的片段。使用5-kb窗口聚合數據并為所有數據集生成單元特征矩陣。為了減少數據集的維度，作者使用了LSI及UMAP進行降維，并使用共享最近鄰 (SNN) 和使用 Signac/Seurat v.3 包實現的Leiden算法對單元進行了聚類。降維和聚類產生了一個被識別為3T3細胞的簇和Oli-neu（Oli-neu_A 和 Oli-neu_B）和 mESC（mES_A 和 mESC_B）的兩個亞簇（下圖a）。作者的數據與其他參考數據集顯示出了告訴的相似性（下圖b）。同時還對前150個最可變的標記峰進行了主成分分析 (PCA)，并觀察到了各自的批量數據和 scCUT&Tag 數據的共聚類和相關性（下圖C）。我們還觀察到相應簇之間的兩個 scCUT&Tag技術復制之間的峰值信號的高度相關性（下圖d）和識別的細胞身份比例的一致性（下圖e）。最后，我們在從ChIP-seq 或 CUT&Run 數據中繪制了縮小的的H3K27me3信號的元基因圖譜，對比發現合并大約 200-500 個3T3細胞和 20-50個mESCs 產生了與之相當的高質量圖譜（下圖f-g）。

附圖1:小鼠細胞系混合物的 scCUT&Tag

結果 

對所有細胞的(de)(de)合(he)并數(shu)據(ju)集(ji)的(de)(de)偽(wei)bulk分(fen)(fen)析顯(xian)示了不同組蛋白(bai)修飾(shi)技術(shu)的(de)(de)特異性。特別是H3K4me3主要存在于轉錄(lu)起(qi)始位點的(de)(de)側翼(yi)區(qu)域(yu)，H3K27ac同時占據(ju)這(zhe)些區(qu)域(yu)和鄰近的(de)(de)基(ji)因(yin)間(jian)區(qu)域(yu)（很(hen)可能是增(zeng)強子），H3K36me3分(fen)(fen)布在整個基(ji)因(yin)體(ti)中。而H3K27me3與其他(ta)活性標(biao)記缺失的(de)(de)基(ji)因(yin)相(xiang)關，或與H3K4me3相(xiang)一致(zhi)。

接下(xia)來，作者(zhe)主要進行了單細胞層面(mian)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)析，作者(zhe)基于每個(ge)barcode中的(de)(de)(de)(de)(de)reads數(shu)及peak區(qu)域的(de)(de)(de)(de)(de)reads比例作為參數(shu)來篩選真實(shi)細胞（PS.10x ATAC中判定peak和(he)(he)細胞很值得(de)一看(kan)）。作者(zhe)獲(huo)得(de)了 47,340 個(ge)單細胞的(de)(de)(de)(de)(de)各(ge)種(zhong)組蛋白修飾的(de)(de)(de)(de)(de) scCUT&Tag 譜，每個(ge)細胞的(de)(de)(de)(de)(de)中位數(shu)在 98個(ge)（H3K36me3）和(he)(he)453個(ge)（H3K27ac）unique fragments左右（圖c）。其中有39.4% 至(zhi) 85.6% 的(de)(de)(de)(de)(de)片段(duan)落(luo)在窄峰區(qu)域內（圖d），表明背景水平較低。片段(duan)長度分(fen)布與亞核(he)小體(ti)(ti)片段(duan)以及所有修飾的(de)(de)(de)(de)(de)單核(he)小體(ti)(ti)、雙核(he)小體(ti)(ti)和(he)(he)三(san)核(he)小體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)捕獲(huo)一致。

同時(shi)作者將數據與(yu)iCell8 scCUT&Tag與(yu)scChIP–seq m比較，指(zhi)紋圖譜顯示，與(yu)scChIP-seq相比，scCUT&Tag具有更(geng)高的(de)特異性和更(geng)好的(de)信噪比，其(qi)特異性水平與(yu)iCell8 scCUT&Tag相似(si)。

為了對細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)進(jin)行(xing)解卷積(ji)和(he)(he)(he)(he)聚類，作(zuo)者使用 5 kb（H3K4me3、H3K27ac 和(he)(he)(he)(he) H3K27me3）以(yi)及 50 kb 的(de)分箱大小（H3K36me3）為所(suo)有(you)數據集(ji)生成(cheng)了細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)特征(zheng)矩陣，并在分析 scCUT&Tag 中(zhong)鑒定了所(suo)有(you)主要(yao)的(de) CNS 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)。（圖(tu)(tu)(tu)(tu) 1f-i 和(he)(he)(he)(he)圖(tu)(tu)(tu)(tu) 2a-f）。通過(guo)識別標記基(ji)因啟動子附近的(de)特定峰(feng)（圖(tu)(tu)(tu)(tu) 1j、k 和(he)(he)(he)(he)圖(tu)(tu)(tu)(tu) 2a-f），我們(men)手動將(jiang)亞群(qun)注(zhu)釋為成(cheng)熟少突(tu)膠質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（MOL、Mbp+、Mog+ 和(he)(he)(he)(he) Cldn11+）、星形膠質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（AST、Slc1a2+、Rfx4+ 和(he)(he)(he)(he)Aqp4+)、嗅鞘(qiao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（OEC、Alx3+、Alx4+ 和(he)(he)(he)(he) Frzb+）、血管細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（VAS、Nes+、Tbx18+ 和(he)(he)(he)(he) Foxf2+）以(yi)及少突(tu)膠質(zhi)祖(zu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao) (OPC)、定型 OPCs (COP) 和(he)(he)(he)(he)新(xin)形成(cheng)的(de)內(nei)突(tu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao) (oligo NFOLs)（Pdgfra+、Neu4+ 和(he)(he)(he)(he) Gpr17+）在 GFP+ 部分（圖(tu)(tu)(tu)(tu) 1j、圖(tu)(tu)(tu)(tu) 2a-f）。GFP? 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)主要(yao)包括神經元（NEU、Rbfox3+ 和(he)(he)(he)(he) Neurod2+）、興奮性（Exc、Slc17a7+）和(he)(he)(he)(he)抑制性（Inh、Gad1+ 和(he)(he)(he)(he) Gad2+）、星形膠質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（Slc1a2+、Rfx4+ 和(he)(he)(he)(he) Aqp4+）和(he)(he)(he)(he)小膠質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)（MGL、C1qa+ 和(he)(he)(he)(he) CDpr4+） （圖(tu)(tu)(tu)(tu) 1j、圖(tu)(tu)(tu)(tu) 2a-f）。我們(men)可以(yi)在 H3K27me3 scCUT&Tag 中(zhong)識別相似(si)的(de)種群(qun)，并使用在標記基(ji)因區(qu)域附近缺乏抑制標記的(de)標記組合對它們(men)進(jin)行(xing)注(zhu)釋（圖(tu)(tu)(tu)(tu) 1j、圖(tu)(tu)(tu)(tu) 2b、d-f）。

在(zai)完成了(le)細胞(bao)類(lei)型鑒定之后，作者發現聚類(lei)在(zai)生物(wu)學(xue)重復中具有(you)高度可重復性(xing)，來(lai)自 P15/P25 年齡的(de)(de)(de)細胞(bao)在(zai)聚類(lei)內很好地混合。OLG 譜(pu)系的(de)(de)(de)細胞(bao)狀態反映了(le)小鼠的(de)(de)(de)年齡，大多數(shu) OPCs 來(lai)自 P15，分(fen)化(hua)的(de)(de)(de) OLG 來(lai)自 P25。有(you)趣的(de)(de)(de)是，我在(zai) Sox10:Cre/RCE 小鼠的(de)(de)(de) GFP+ 部分(fen)中檢測到一(yi)個主要(yao)的(de)(de)(de)、可能(neng)是瞬時的(de)(de)(de) AST 群體，最有(you)可能(neng)來(lai)自腹(fu)側區(qu)域(yu)（ventral regions）。

圖1：細胞類型鑒定注釋

圖2：基于scCUT&Tag標記區域的細胞亞群從頭鑒定

為了驗(yan)證亞(ya)群(qun)(qun)(qun)的(de)手動(dong)注釋(shi)的(de)準(zhun)確(que)性(xing)，我(wo)們(men)使(shi)(shi)用了青春期小(xiao)鼠大腦 scRNA-seq atlas1。我(wo)們(men)為選定的(de)群(qun)(qun)(qun)體(ti)挑選了100個最(zui)特(te)異表達(da)的(de)標記基(ji)(ji)因，生(sheng)成(cheng)元基(ji)(ji)因模(mo)塊，然后(hou)計算模(mo)塊內的(de)基(ji)(ji)因活(huo)性(xing)評分（基(ji)(ji)因體(ti)和啟動(dong)子中的(de) scCUT&Tag 信號）。我(wo)們(men)發(fa)現特(te)定細(xi)(xi)胞(bao)簇顯(xian)示(shi)出主(zhu)動(dong)修飾的(de)元基(ji)(ji)因信號富集(ji)，并且在 H3K27me3 數(shu)據集(ji)中耗盡，證明(ming)了亞(ya)群(qun)(qun)(qun)注釋(shi)的(de)準(zhun)確(que)性(xing)。此(ci)外(wai)，作者(zhe)在單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)水平上使(shi)(shi)用典型相關(guan)分析(xi) (CCA) 將 H3K4me3 scCUT&Tag 與 scRNA-seq 數(shu)據進行整合，發(fa)現主(zhu)要細(xi)(xi)胞(bao)群(qun)(qun)(qun)與相應的(de) scRNA-seq 群(qun)(qun)(qun)聚在一起(qi)（圖3a）。最(zui)后(hou)，使(shi)(shi)用基(ji)(ji)因本體(ti) (GO) 術(shu)語分析(xi)對(dui) H3K4me3 scCUT&Tag 簇進行功(gong)能注釋(shi)，并發(fa)現了 不(bu)同的(de)GO通路富集(ji)，例如(ru)星(xing)形(xing)(xing)膠質細(xi)(xi)胞(bao)分化和激活(huo) (AST)、髓(sui)鞘(qiao)形(xing)(xing)成(cheng) (OLG)、髓(sui)鞘(qiao)形(xing)(xing)成(cheng)調節 (OEC)、參與血管生(sheng)成(cheng)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)遷移(VAS)、神經(jing)膠質細(xi)(xi)胞(bao)發(fa)育(yu) (OPCs)、神經(jing)元發(fa)育(yu)、神經(jing)元成(cheng)熟和軸(zhou)突生(sheng)成(cheng) (NEU) 以及參與免疫反(fan)應的(de)小(xiao)膠質細(xi)(xi)胞(bao)激活(huo) (MGL)在各自的(de)亞(ya)群(qun)(qun)(qun)中被富集(ji)到。

之前的(de)(de)(de)(de)一項(xiang)研(yan)究表明，可(ke)以(yi)在少突(tu)膠質細(xi)胞群中檢測(ce)到更多的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞亞(ya)型。作(zuo)者(zhe)想到是否可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)將(jiang) scCUT&Tag 數(shu)據與現有(you)(you)OLG scRNA-seq 數(shu)據集(ji)集(ji)成來(lai)解決這種異質性(xing)(xing)(xing)。為(wei)此，作(zuo)者(zhe)使(shi)用 CCA 整合(he)了(le)H3K4me3 scCUT&Tag和 scRNA-seq，獲得了(le)較為(wei)理(li)想的(de)(de)(de)(de)整合(he)結(jie)果(guo)，并(bing)且保(bao)留了(le) scRNA-seq 聚類結(jie)果(guo)（圖(tu)(tu)3b）。然后作(zuo)者(zhe)使(shi)用 OPC、MFOL、MOL1、MOL2 和 MOL5 的(de)(de)(de)(de)元基因(yin)評分來(lai)揭示 H3K4me3 scCUT&Tag 數(shu)據中的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞亞(ya)型特(te)征(zheng)，有(you)(you)趣的(de)(de)(de)(de)是，作(zuo)者(zhe)發(fa)現看起來(lai)同質的(de)(de)(de)(de)少突(tu)膠質細(xi)胞群可(ke)以(yi)進一步(bu)解卷積為(wei)富(fu)含模塊特(te)異性(xing)(xing)(xing)基因(yin)的(de)(de)(de)(de)亞(ya)群（圖(tu)(tu) 3c），表明少突(tu)膠質細(xi)胞異質性(xing)(xing)(xing)反(fan)映(ying)在表觀遺(yi)傳水平。

圖3：H3K4me3 scCUT&Tag數據與小鼠腦圖譜 scRNA-seq數據的整合分析

由(you)(you)(you)(you)于 scCUT&Tag配置文件是(shi)(shi)針對(dui)所有(you)現(xian)有(you)亞群(qun)同(tong)時生成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，因(yin)此(ci)(ci)可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)對(dui)其全(quan)局和(he)(he)全(quan)基(ji)因(yin)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)蛋白(bai)修(xiu)(xiu)飾(shi)模式進行(xing)定量(liang)(liang)分(fen)析(xi)。作(zuo)(zuo)者使用每(mei)個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)唯一(yi)(yi)reads數作(zuo)(zuo)為單個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)蛋白(bai)修(xiu)(xiu)飾(shi)絕對(dui)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)代(dai)表(biao)(biao)(biao)。并(bing)且發(fa)現(xian)在(zai)不(bu)同(tong)亞群(qun)間(jian)(jian)(jian)這方(fang)面存在(zai)很大差異(yi)（圖(tu)(tu)(tu)3d）。這對(dui)于H3K27me3最為突(tu)出，相對(dui)于其他群(qun)體(ti)(ti)，它富含少(shao)(shao)突(tu)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)、小(xiao)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)一(yi)(yi)部分(fen)神經元（圖(tu)(tu)(tu)3d）。少(shao)(shao)突(tu)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)H3K27me3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)富集(ji)與最近(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)現(xian)一(yi)(yi)致(zhi)，即(ji)H3K27me3在(zai)發(fa)育過程(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)驅動少(shao)(shao)突(tu)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao) - 星(xing)(xing)形膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉換(huan)。有(you)趣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)，我們(men)還在(zai)未成(cheng)熟少(shao)(shao)突(tu)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)（OPC/COP-NFOL 階段）中(zhong)(zhong)(zhong)觀(guan)(guan)察到相對(dui)較高量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) H3K36me3（圖(tu)(tu)(tu)3d）。盡(jin)(jin)管(guan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)型中(zhong)(zhong)(zhong)抗體(ti)(ti)特(te)(te)異(yi)性(xing)(xing)(xing)信號(hao)(hao)全(quan)局水(shui)(shui)平的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)異(yi)質(zhi)(zhi)性(xing)(xing)(xing)可(ke)(ke)(ke)能(neng)是(shi)(shi)由(you)(you)(you)(you)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)滲(shen)透性(xing)(xing)(xing)和(he)(he)/或(huo)標(biao)記(ji)(ji)(ji)引(yin)(yin)(yin)起(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，但我們(men)沒(mei)有(you)注(zhu)意到特(te)(te)定細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)型中(zhong)(zhong)(zhong)所有(you)組(zu)蛋白(bai)修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)信號(hao)(hao)富集(ji)一(yi)(yi)致(zhi)。因(yin)此(ci)(ci)，信號(hao)(hao)異(yi)質(zhi)(zhi)性(xing)(xing)(xing)不(bu)太可(ke)(ke)(ke)能(neng)是(shi)(shi)由(you)(you)(you)(you)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)型之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差異(yi)標(biao)記(ji)(ji)(ji)效率引(yin)(yin)(yin)起(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，而是(shi)(shi)由(you)(you)(you)(you)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)型之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)同(tong)修(xiu)(xiu)飾(shi)水(shui)(shui)平造成(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。作(zuo)(zuo)者接下(xia)來好奇是(shi)(shi)否(fou)可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)在(zai)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)修(xiu)(xiu)飾(shi)中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)配細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)群(qun)并(bing)將它們(men)相互關聯。由(you)(you)(you)(you)此(ci)(ci)，作(zuo)(zuo)者使用CCA以(yi)(yi)基(ji)因(yin)分(fen)辨率整合數據(ju)(ju)。引(yin)(yin)(yin)人注(zhu)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)，所獲得數據(ju)(ju)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二維即(ji)可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)高精度重(zhong)現(xian)了原(yuan)始(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)監督聚類(lei)(lei)(lei)(lei)（圖(tu)(tu)(tu)3e），并(bing)且在(zai)不(bu)同(tong)數據(ju)(ju)集(ji)中(zhong)(zhong)(zhong)用相同(tong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)型注(zhu)釋的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)亞群(qun)在(zai)空(kong)間(jian)(jian)(jian)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)位(wei)置也(ye)類(lei)(lei)(lei)(lei)似（圖(tu)(tu)(tu)3e）。為了進一(yi)(yi)步(bu)檢查(cha)活(huo)性(xing)(xing)(xing)標(biao)記(ji)(ji)(ji)和(he)(he)抑制(zhi)標(biao)記(ji)(ji)(ji)之(zhi)(zhi)間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相互作(zuo)(zuo)用，作(zuo)(zuo)者確定了對(dui)由(you)(you)(you)(you)H3K4me3標(biao)記(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)個(ge)體(ti)(ti)群(qun)體(ti)(ti)特(te)(te)異(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)所有(you)活(huo)性(xing)(xing)(xing)啟動子，并(bing)繪制(zhi)了所有(you)群(qun)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)每(mei)個(ge)簇的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) H3K4me3（圖(tu)(tu)(tu)3f）和(he)(he) H3K27me3（圖(tu)(tu)(tu)3g）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)信號(hao)(hao)。正如預期(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)那樣，當啟動子富含 H3K4me3 時，可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)觀(guan)(guan)察到 H3K27me3 耗(hao)盡(jin)(jin)（圖(tu)(tu)(tu)3g）。有(you)趣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)，作(zuo)(zuo)者注(zhu)意到星(xing)(xing)形膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)特(te)(te)異(yi)性(xing)(xing)(xing)基(ji)因(yin)在(zai)OPCs中(zhong)(zhong)(zhong)比在(zai) MOLs 中(zhong)(zhong)(zhong)具有(you)更高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)H3K4me3信號(hao)(hao)（圖(tu)(tu)(tu)3f）。此(ci)(ci)外，H3K27me3信號(hao)(hao)從MOL中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) OPC特(te)(te)異(yi)性(xing)(xing)(xing)基(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)耗(hao)盡(jin)(jin)，但在(zai)星(xing)(xing)形膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)沒(mei)有(you)（圖(tu)(tu)(tu)3g），表(biao)(biao)(biao)明H3K27me3在(zai)MOL分(fen)化過程(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)不(bu)需要抑制(zhi)OPC基(ji)因(yin)。相比之(zhi)(zhi)下(xia)，H3K27me3信號(hao)(hao)存在(zai)于OPC和(he)(he)MOL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)AST特(te)(te)異(yi)性(xing)(xing)(xing)基(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)（圖(tu)(tu)(tu)3g）。最近(jin)有(you)報道稱，H3K27me3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)(zhong)斷會損(sun)害(hai) OPC向(xiang)(xiang)MOL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)化，并(bing)觸發(fa)向(xiang)(xiang)星(xing)(xing)形細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)命運的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉變。此(ci)(ci)外，所呈現(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)觀(guan)(guan)遺傳圖(tu)(tu)(tu)譜表(biao)(biao)(biao)明AST在(zai)表(biao)(biao)(biao)觀(guan)(guan)遺傳上(shang)（H3K4me3）與 OPCs相關。

H3K4me3標(biao)記的(de)(de)(de)(de)廣度(du)(du)之(zhi)前與各(ge)種細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型、基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)表達和轉(zhuan)錄一致性(xing)(xing)相(xiang)關聯。我(wo)們在(zai)H3K4me3堆(dui)積分(fen)析中注意到，與其(qi)他亞群的(de)(de)(de)(de)標(biao)記基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)啟(qi)動(dong)子(zi)相(xiang)比(bi)，亞群特(te)異性(xing)(xing)標(biao)記基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)啟(qi)動(dong)子(zi)的(de)(de)(de)(de)H3K4me3信號(hao)的(de)(de)(de)(de)幅度(du)(du)和寬(kuan)度(du)(du)都(dou)增加了（附圖2）。為了量化(hua)廣度(du)(du)，作者專門研究(jiu)(jiu)了從scRNA-seq數據(ju)中識別(bie)出(chu)的(de)(de)(de)(de)標(biao)記基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)啟(qi)動(dong)子(zi)。作者發現已鑒定種群的(de)(de)(de)(de)標(biao)記基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)平均具(ju)有更(geng)高(gao)的(de)(de)(de)(de)H3K4me3寬(kuan)度(du)(du)（圖4a）。此外，單(dan)個細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型的(de)(de)(de)(de)寬(kuan)度(du)(du)大小不同，AST和少突膠質細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)啟(qi)動(dong)子(zi)上(shang)的(de)(de)(de)(de)H3K4me3峰最寬(kuan)，血(xue)管(guan)和軟腦膜細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao) (VLMC) 和OPCs上(shang)的(de)(de)(de)(de)峰最窄（圖4b），這(zhe)可能表明從祖細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)狀態到完(wan)全分(fen)化(hua)狀態的(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)變過(guo)程中H3K4me3的(de)(de)(de)(de)寬(kuan)度(du)(du)增加。為了進(jin)(jin)一步研究(jiu)(jiu)H3K4me3傳播的(de)(de)(de)(de)動(dong)態，作者基(ji)(ji)(ji)(ji)于(yu)scCUT&Tag，以單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)辨率可視化(hua)H3K4me3的(de)(de)(de)(de)傳播，并在(zai)從OPCs分(fen)化(hua)MOL的(de)(de)(de)(de)過(guo)程中研究(jiu)(jiu)了H3K4me3的(de)(de)(de)(de)廣度(du)(du)。作者圍繞MOL特(te)異性(xing)(xing)標(biao)記基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)生成(cheng)了單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)H3K4me3元基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)圖譜。然(ran)后我(wo)們根(gen)據(ju)來自MOL中表達的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)H3K4me3 信號(hao)（MOL簽名）對(dui)矩(ju)陣中的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（OPC和 MOL）進(jin)(jin)行(xing)(xing)排(pai)序(xu)，并通過(guo)擬時序(xu)分(fen)析進(jin)(jin)行(xing)(xing)驗證（圖 4c、d）。引人注目的(de)(de)(de)(de)是，可以觀察到H3K4me3信號(hao)在(zai)MOL啟(qi)動(dong)子(zi)處的(de)(de)(de)(de)寬(kuan)度(du)(du)逐(zhu)漸增加，具(ju)有單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)分(fen)辨率（圖4e），這(zhe)與H3K4me3隨著細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)向分(fen)化(hua)的(de)(de)(de)(de)少突膠質細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)特(te)征進(jin)(jin)展時的(de)(de)(de)(de)擴散(san)一致。

圖 4：在單細胞分辨率下H3K4me3標記在啟動子上的傳播

附圖2：四種組蛋白修飾的亞群的scCUT&Tag表達

眾所周知，在(zai)(zai)(zai)low input樣本中(zhong)(zhong)(zhong)使(shi)用ChIP-seq很(hen)難分析(xi) TF 結(jie)合。因(yin)此，作(zuo)(zuo)者好(hao)奇scCUT&Tag是(shi)否能(neng)夠以(yi)單(dan)細(xi)胞(bao)(bao)分辨(bian)率揭示 TF 的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)合，于是(shi)他們選(xuan)(xuan)擇(ze)了(le)(le)(le)TFs OLIG2，其對(dui)神經膠質群(qun)(qun)(qun)體(ti)具有特(te)異(yi)性(xing)(xing)，另外(wai)選(xuan)(xuan)擇(ze)了(le)(le)(le)RAD21,其是(shi)一(yi)(yi)(yi)種(zhong)通(tong)用染(ran)色(se)質結(jie)構因(yin)子和(he)(he)cohesin復(fu)合物的(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)基。作(zuo)(zuo)者對(dui)出(chu)生后第 25 天的(de)(de)(de)(de)(de)小鼠(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)大腦(nao)的(de)(de)(de)(de)(de)GFP+分選(xuan)(xuan)細(xi)胞(bao)(bao)進行了(le)(le)(le)scCUT&Tag。與(yu)(yu)(yu)組蛋白(bai)修飾相(xiang)比(bi)，TF scCUT&Tag 的(de)(de)(de)(de)(de)每個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)獨特(te)讀取數(shu)較低。盡管如此，在(zai)(zai)(zai)OLIG2和(he)(he)RAD21 scCUT&Tag獲得唯(wei)一(yi)(yi)(yi)reads的(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)(zhong)位數(shu)依然(ran)在(zai)(zai)(zai)48 and 240。使(shi)用 LSI和(he)(he)UMAP進行降(jiang)維，并(bing)(bing)獲得了(le)(le)(le)RAD21和(he)(he)OLIG2的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)定集群(qun)(qun)(qun)（圖(tu) 5a-d）。可以(yi)看到OLIG2的(de)(de)(de)(de)(de)兩(liang)個(ge)(ge)亞(ya)群(qun)(qun)(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)唯(wei)一(yi)(yi)(yi)reads的(de)(de)(de)(de)(de)差別交(jiao)大，作(zuo)(zuo)者將(jiang)具有低唯(wei)一(yi)(yi)(yi)reads的(de)(de)(de)(de)(de)集群(qun)(qun)(qun)注(zhu)釋為(wei)“low binders”（圖(tu) 5a）。由于在(zai)(zai)(zai)TF CUT&Tag中(zhong)(zhong)(zhong)基于標(biao)記手動注(zhu)釋種(zhong)群(qun)(qun)(qun)具有挑戰(zhan)性(xing)(xing)（圖(tu) 5e），基于亞(ya)群(qun)(qun)(qun)注(zhu)釋的(de)(de)(de)(de)(de)假設是(shi)特(te)定細(xi)胞(bao)(bao)類型中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)OLIG2/RAD21結(jie)合與(yu)(yu)(yu)增強子/啟動子活(huo)性(xing)(xing)相(xiang)關。因(yin)此，作(zuo)(zuo)者分析(xi)了(le)(le)(le)OLIG2/RAD21 在(zai)(zai)(zai)scCUT&Tag數(shu)據中(zhong)(zhong)(zhong)被H3K4me3特(te)異(yi)性(xing)(xing)修飾的(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)啟動子區域中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)合，并(bing)(bing)確定了(le)(le)(le)RAD21 scCUT&Tag中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de) AST、OLG 和(he)(he)OEC群(qun)(qun)(qun)以(yi)及OLIG2 scCUT&Tag 中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)OLG和(he)(he)非(fei)OLG（“low binders”）。OLIG2 scCUT&Tag中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)OLG種(zhong)群(qun)(qun)(qun)可能(neng)由成(cheng)熟的(de)(de)(de)(de)(de)OLG和(he)(he)OPC組成(cheng)，它們似乎在(zai)(zai)(zai)OLG 集群(qun)(qun)(qun)中(zhong)(zhong)(zhong)形成(cheng)了(le)(le)(le)一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)亞(ya)種(zhong)群(qun)(qun)(qun)。為(wei)了(le)(le)(le)進一(yi)(yi)(yi)步分辨(bian)亞(ya)群(qun)(qun)(qun)注(zhu)釋，作(zuo)(zuo)者將(jiang)RAD21/OLIG2與(yu)(yu)(yu)另一(yi)(yi)(yi)種(zhong)組蛋白(bai)修飾（使(shi)用CCA的(de)(de)(de)(de)(de)H3K27ac）整(zheng)(zheng)合，發(fa)現識別的(de)(de)(de)(de)(de)簇(cu)始終與(yu)(yu)(yu)相(xiang)應的(de)(de)(de)(de)(de)H3K27ac簇(cu)合并(bing)(bing)。有趣的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，“low binders”中(zhong)(zhong)(zhong)非(fei)OLG 細(xi)胞(bao)(bao)隨(sui)機與(yu)(yu)(yu)H3K27ac定義的(de)(de)(de)(de)(de)OEC、AST 和(he)(he)血(xue)管細(xi)胞(bao)(bao)簇(cu)群(qun)(qun)(qun)合并(bing)(bing)，而OLG簇(cu)與(yu)(yu)(yu)OLG H3K27ac 信號特(te)異(yi)性(xing)(xing)合并(bing)(bing)。這(zhe)一(yi)(yi)(yi)發(fa)現與(yu)(yu)(yu)Olig2 在(zai)(zai)(zai)整(zheng)(zheng)個(ge)(ge)細(xi)胞(bao)(bao)類型中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)表達一(yi)(yi)(yi)致，它在(zai)(zai)(zai)整(zheng)(zheng)個(ge)(ge)OLG 譜系中(zhong)(zhong)(zhong)高(gao)度表達，而 OEC和(he)(he)VLMC不表達Olig2，只有一(yi)(yi)(yi)小部分AST表達Olig2（圖(tu) 5f）。

為了(le)驗證scCUT&Tag的(de)(de)(de)特異(yi)(yi)性，作者(zhe)在 RAD21和(he)(he)OLIG2的(de)(de)(de)合并偽批量數(shu)據集(ji)中使用(yong) MEME 套件(jian)在結合位點中搜索了(le)富(fu)(fu)集(ji)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)。作者(zhe)發(fa)現染(ran)色質結構因子CTCF的(de)(de)(de)基(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)在RAD21數(shu)據集(ji)中最高富(fu)(fu)集(ji)（圖5g），這與(yu)CTCF和(he)(he) cohesin 之間的(de)(de)(de)協(xie)(xie)同性一(yi)(yi)致。我們發(fa)現了(le)幾(ji)個富(fu)(fu)含OLIG2 scCUT&Tag的(de)(de)(de)基(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)，包括CAGMTG基(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)，類似于(yu)先前在小鼠(shu)(shu)  和(he)(he)大鼠(shu)(shu)中分別對OLIG2特異(yi)(yi)的(de)(de)(de) CAGMTG/CAGCTG基(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)（圖 5h）。連同先前確(que)定的(de)(de)(de)OLIG2基(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)，作者(zhe)發(fa)現了(le)多種通用(yong)真核增強子和(he)(he)啟動(dong)子特征(zheng)（GC框和(he)(he)CAAT框）的(de)(de)(de)富(fu)(fu)集(ji)。有趣的(de)(de)(de)是(shi)，作者(zhe)還發(fa)現了(le)一(yi)(yi)個類似于(yu)來自SOX家(jia)族的(de)(de)(de)TF的(de)(de)(de)基(ji)(ji)序(xu)(xu)(xu)（ACARWR，擴展數(shu)據圖 9f），這與(yu)OLIG2和(he)(he)SOX家(jia)族TF（SOX8、SOX10）成員之間的(de)(de)(de)物理相互作用(yong)和(he)(he)協(xie)(xie)同性一(yi)(yi)致.

圖 5：轉錄因子結合的 scCUT&Tag 分析

總結 

篇幅原(yuan)因，今天就先介紹到這里，這篇文章的(de)亮點頗多，基于微流(liu)控的(de)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)CUT&Tag可(ke)以(yi)更加特異的(de)分(fen)析單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)水平的(de)各種修飾情況；與(yu)不(bu)同的(de)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)數據的(de)結合(he)分(fen)析為探究更精(jing)細(xi)(xi)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)異質性提供(gong)了思(si)路，對于研究復雜樣本與(yu)組織的(de)老(lao)師同學們值得借(jie)鑒(jian)。