開篇明義，作者構建了一(yi)種(zhong)叫(jiao)做slide-DNA-seq的方法，可(ke)以實現能夠對(dui)完(wan)整(zheng)組織進行空間(jian)分辨DNA測序。

作(zuo)者(zhe)首先制作(zuo)了(le)(le)(le)一(yi)個(ge)3毫(hao)米(mi)(mi)beads的(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)間索引(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列，和slide-RNA-seq類似(si)。每(mei)個(ge)10微米(mi)(mi)的(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)苯乙(yi)烯珠(zhu)包含一(yi)個(ge)獨特的(de)(de)(de)(de)(de)DNA條(tiao)(tiao)形(xing)碼(ma)，該條(tiao)(tiao)形(xing)碼(ma)對應于一(yi)個(ge)空(kong)(kong)間位(wei)(wei)置(zhi)，并(bing)(bing)(bing)且連(lian)接接頭引(yin)(yin)物等序(xu)列。然后(hou)(hou)將(jiang)組(zu)(zu)織切(qie)片(pian)(pian)(pian)冷凍(dong)，并(bing)(bing)(bing)將(jiang)單個(ge)10微米(mi)(mi)的(de)(de)(de)(de)(de)新鮮冷凍(dong)切(qie)片(pian)(pian)(pian)轉移到(dao)測序(xu)珠(zhu)陣列上(shang)。為(wei)了(le)(le)(le)實現DNA的(de)(de)(de)(de)(de)無偏(pian)捕獲(huo)，組(zu)(zu)織切(qie)片(pian)(pian)(pian)用HCl處理以(yi)去除組(zu)(zu)蛋(dan)白并(bing)(bing)(bing)用Tn5轉座以(yi)創(chuang)建(jian)(jian)兩側有定制接頭序(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)基因組(zu)(zu)片(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)。然后(hou)(hou)從bead上(shang)光(guang)斷裂空(kong)(kong)間條(tiao)(tiao)形(xing)碼(ma)，將(jiang)它們連(lian)接到(dao)近端(duan)基因組(zu)(zu)片(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)，并(bing)(bing)(bing)通過PCR擴(kuo)增得到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)DNA測序(xu)文(wen)庫(ku)（圖1b)。在(zai)文(wen)庫(ku)構建(jian)(jian)之后(hou)(hou)，使(shi)用高通量(liang)雙端(duan)測序(xu)，并(bing)(bing)(bing)使(shi)用DNA條(tiao)(tiao)形(xing)碼(ma)將(jiang)每(mei)個(ge)基因組(zu)(zu)片(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)與(yu)磁珠(zhu)陣列上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)間位(wei)(wei)置(zhi)相關(guan)聯。這(zhe)些(xie)關(guan)聯使(shi)后(hou)(hou)續分析能夠重建(jian)(jian)組(zu)(zu)織中(zhong)DNA的(de)(de)(de)(de)(de)空(kong)(kong)間位(wei)(wei)置(zhi)，而(er)無需(xu)在(zai)顯微鏡下對樣本進(jin)行成(cheng)像。同(tong)時，作(zuo)者(zhe)針對組(zu)(zu)織固定、組(zu)(zu)蛋(dan)白去除和橋接寡核苷(gan)酸雜(za)交(jiao)進(jin)行了(le)(le)(le)優化(hua)，均一(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)最大(da)化(hua)文(wen)庫(ku)大(da)小，使(shi)Tn5對染(ran)色質的(de)(de)(de)(de)(de)切(qie)割均勻，同(tong)時保留了(le)(le)(le)組(zu)(zu)織結構。在(zai)完成(cheng)最初的(de)(de)(de)(de)(de)優化(hua)之后(hou)(hou)，每(mei)個(ge)陣列包含20,000到(dao)40,000個(ge)bead，每(mei)個(ge)bead的(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)位(wei)(wei)數為(wei)165到(dao)421個(ge)片(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)。此(ci)外，作(zuo)者(zhe)開發(fa)了(le)(le)(le)一(yi)種概念性的(de)(de)(de)(de)(de)修改版的(de)(de)(de)(de)(de)方法，它使(shi)用重復的(de)(de)(de)(de)(de)Tn5標(biao)記(ji)來(lai)提高產量(liang)，可以(yi)使(shi)基因組(zu)(zu)捕獲(huo)片(pian)(pian)(pian)段(duan)(duan)增加(jia)十倍。

為(wei)了確(que)定(ding)這(zhe)種方(fang)法(fa)的(de)(de)空間(jian)(jian)和基因(yin)組分(fen)辨率(lv)，作者(zhe)將slide-DNA-seq應用于小(xiao)(xiao)鼠小(xiao)(xiao)腦，該小(xiao)(xiao)鼠小(xiao)(xiao)腦包含不同(tong)的(de)(de)核(he)密集（體(ti)(ti)細胞）和富(fu)含線(xian)粒體(ti)(ti)，作者(zhe)使用DAPI和針對線(xian)粒體(ti)(ti)蛋白TOMM20的(de)(de)抗體(ti)(ti)染色（圖(tu)1e），圖(tu)1d圖(tu)是(shi)基于線(xian)粒體(ti)(ti)的(de)(de)百分(fen)比進(jin)行著色，兩者(zhe)之間(jian)(jian)具有很好(hao)的(de)(de)相似度。為(wei)了測量基因(yin)組上(shang)的(de)(de)分(fen)辨率(lv)，作者(zhe)使用相同(tong)組織的(de)(de)bulk測序校(xiao)正了序列偏(pian)差(cha)和歸一化(hua)覆蓋率(lv)的(de)(de)數(shu)(shu)據。基于這(zhe)種方(fang)法(fa)，99.78%的(de)(de)非重疊1Mb基因(yin)組bin的(de)(de)標準化(hua)拷貝數(shu)(shu)在1.5和2.5之間(jian)(jian)（圖(tu)1f）。總之，這(zhe)些數(shu)(shu)據表明，slide-DNA-seq可以在空間(jian)(jian)上(shang)定(ding)位正常組織內的(de)(de)基因(yin)組信(xin)息。

接下來(lai)，作者將slide-DNA-seq來(lai)應用于(yu)測量(liang)腫(zhong)瘤(liu)切片中(zhong)拷貝數改變(CNA)的(de)(de)空(kong)間分布，使用已知(zhi)具有染色體擴增和缺失的(de)(de)肺(fei)腺(xian)癌基因工程(cheng)小(xiao)(xiao)鼠(shu)模型，作者從(cong)KrasG12D/+Trp53-/-(KP)小(xiao)(xiao)鼠(shu)肺(fei)腫(zhong)瘤(liu)中(zhong)分離并擴增了(le)單個腫(zhong)瘤(liu)克(ke)隆，并將該克(ke)隆注射到小(xiao)(xiao)鼠(shu)的(de)(de)尾靜脈(mo)中(zhong)，從(cong)而在(zai)肝臟(zang)中(zhong)引起(qi)大的(de)(de)轉(zhuan)移，構建腫(zhong)瘤(liu)轉(zhuan)移模型。

在分(fen)(fen)析方法(fa)上，作者開發了一個幻燈(deng)片(pian)-DNA-seq分(fen)(fen)析工作流程，包括兩個主(zhu)要步驟：（1）克隆群體(ti)的從頭識(shi)別和空間定(ding)位（2）每個克隆的基因組CNA的表征。

首(shou)先，為了(le)檢測(ce)和定位組織內(nei)的(de)(de)(de)(de)腫(zhong)瘤(liu)(liu)克(ke)隆，我們根(gen)據空間接(jie)近度（k=50個(ge)(ge)最近的(de)(de)(de)(de)beads，直徑在110微(wei)米(mi)）對beads數據進行(xing)平(ping)滑處理(li)并(bing)執(zhi)行(xing)主成分(fen)(fen)分(fen)(fen)析(xi)(PCA)以找到(dao)在整個(ge)(ge)組織中(zhong)具有可變覆(fu)蓋率的(de)(de)(de)(de)共同相關基因(yin)組區域(yu)。然后，通(tong)過k-means聚(ju)類為slide-DNA-seq陣列(lie)上的(de)(de)(de)(de)每(mei)個(ge)(ge)beads分(fen)(fen)配一個(ge)(ge)克(ke)隆型。基于這(zhe)種方(fang)法(fa)應用于來(lai)自肝轉移瘤(liu)(liu)的(de)(de)(de)(de)slide-DNA-seq陣列(lie)時，主成分(fen)(fen)1（PC1解釋了(le)2.89%的(de)(de)(de)(de)方(fang)差）顯示(shi)出空間圖(tu)案（圖(tu)1h）與(yu)對晚期腫(zhong)瘤(liu)(liu)標志物(wu)HMGA2在連續切片(pian)上的(de)(de)(de)(de)免疫(yi)熒光染色(se)一致。同時為了(le)驗證這(zhe)種方(fang)法(fa)是否可用于識別遺傳上不同的(de)(de)(de)(de)腫(zhong)瘤(liu)(liu)克(ke)隆，作(zuo)者對4個(ge)(ge)腫(zhong)瘤(liu)(liu)細胞系(xi)的(de)(de)(de)(de)bulk測(ce)序進行(xing)了(le)下采樣分(fen)(fen)析(xi)，發現于每(mei)個(ge)(ge)樣本僅有1000個(ge)(ge)片(pian)段也(ye)顯示(shi)出較好(hao)的(de)(de)(de)(de)穩(wen)健(jian)性。表明(ming)該策略中(zhong)數據量對于slide-DNA-seq是足夠的(de)(de)(de)(de)。

分析工作(zuo)流程(cheng)中(zhong)的(de)(de)第(di)二個任務是表征每(mei)個腫(zhong)瘤克隆中(zhong)存在(zai)的(de)(de)CNA。作(zuo)者以1Mb的(de)(de)分辨(bian)率(lv)(lv)可視(shi)化了每(mei)個集群的(de)(de)基(ji)因組覆蓋率(lv)(lv)。當應用于肝(gan)轉(zhuan)移隊列中(zhong)，腫(zhong)瘤相(xiang)關簇(cu)顯示出顯著的(de)(de)CNA，包(bao)括染(ran)色體chr6的(de)(de)擴增(zeng)，這是KRAS誘(you)導的(de)(de)肺腫(zhong)瘤的(de)(de)特征，而正常簇(cu)顯示出相(xiang)對均勻的(de)(de)覆蓋（圖(tu)1j）。

基(ji)于以上的結果，表(biao)明(ming)了(le)slide-DNA-seq分析工(gong)作流程(cheng)能夠以大(da)約1-Mb 的基(ji)因組分辨(bian)率從頭發現和定(ding)位腫瘤區域(yu)。

為了(le)證明該(gai)(gai)實(shi)驗和(he)計算方法(fa)(fa)可(ke)以(yi)(yi)區(qu)分組織內(nei)的(de)(de)克隆(long)(long)，作(zuo)者(zhe)將(jiang)源自兩(liang)個(ge)(ge)獨立衍生的(de)(de)轉(zhuan)移性 KP 腫瘤(liu)的(de)(de)多個(ge)(ge)克隆(long)(long)注射到(dao)小鼠的(de)(de)尾(wei)靜脈中，這會(hui)在(zai)(zai)肝(gan)臟中產生大的(de)(de)轉(zhuan)移。然后(hou)作(zuo)者(zhe)進行了(le) H&E 染色(se)并確定(ding)了(le)一個(ge)(ge)組織區(qu)域，該(gai)(gai)區(qu)域具(ju)有(you)兩(liang)個(ge)(ge)空(kong)間上(shang)不(bu)同的(de)(de)轉(zhuan)移灶（圖(tu)(tu)2a）。同時作(zuo)者(zhe)也(ye)是(shi)(shi)用了(le)免疫(yi)組化進行了(le)進一步(bu)的(de)(de)確認。作(zuo)者(zhe)使(shi)用slide-DNA-seq對第三張切(qie)片進行了(le)測(ce)序，發現使(shi)用上(shang)面描述的(de)(de)方法(fa)(fa)后(hou)，基于PC1與PC2可(ke)以(yi)(yi)明顯的(de)(de)分辨出兩(liang)個(ge)(ge)腫瘤(liu)轉(zhuan)移灶（圖(tu)(tu)2b）。作(zuo)者(zhe)開發了(le)一種置(zhi)換檢(jian)驗的(de)(de)方法(fa)(fa)以(yi)(yi)在(zai)(zai)空(kong)間定(ding)位一個(ge)(ge)或(huo)兩(liang)個(ge)(ge)轉(zhuan)移灶中存(cun)在(zai)(zai)的(de)(de)具(ju)有(you)統計學意(yi)義的(de)(de) CNA gain或(huo)loss，并檢(jian)測(ce)到(dao) chr6、chr15 和(he) chr19 上(shang)的(de)(de)差異(yi)區(qu)域（圖(tu)(tu)2c）。作(zuo)者(zhe)在(zai)(zai)全基因(yin)組上(shang)比較了(le)選定(ding)區(qu)域覆(fu)蓋率的(de)(de)統計顯著性（雙(shuang)邊Wilcoxon秩(zhi)和(he)檢(jian)驗；圖(tu)(tu)2d中的(de)(de)P值），進一步(bu)證明它們是(shi)(shi)由不(bu)同的(de)(de)克隆(long)(long)播種的(de)(de)。此(ci)外，作(zuo)者(zhe)觀察到(dao)一個(ge)(ge)克隆(long)(long)可(ke)能是(shi)(shi)三倍體(ti)，并且使(shi)用流式細(xi)胞術(shu)獨立證實(shi)了(le)這一點。

為了(le)(le)測試兩(liang)(liang)個克(ke)(ke)隆(long)(long)之間的(de)(de)(de)遺傳差異是否(fou)反映在(zai)細胞狀態中，作(zuo)者在(zai)第四個切片上(shang)使用(yong)了(le)(le)slide-rna-seq進行(xing)單細胞核轉錄(lu)組測序，基于(yu)單細胞核轉錄(lu)組的(de)(de)(de)無監督聚類與(yu)在(zai)slide-rna-seq上(shang)的(de)(de)(de)空間映射，顯示出兩(liang)(liang)個轉移在(zai)轉錄(lu)水(shui)平上(shang)也(ye)是不一(yi)致(zhi)的(de)(de)(de)（圖2e），分析發現在(zai)兩(liang)(liang)個克(ke)(ke)隆(long)(long)間有(you)3,732 個基因差異表(biao)(biao)達(da)(da)（圖2f）。接下來(lai)，作(zuo)者分析了(le)(le)一(yi)下兩(liang)(liang)個克(ke)(ke)隆(long)(long)差異表(biao)(biao)達(da)(da)的(de)(de)(de)明(ming)星基因。克(ke)(ke)隆(long)(long) A 具有(you)較高的(de)(de)(de)晚期腫(zhong)瘤(liu)(liu)標志(zhi)物(wu)表(biao)(biao)達(da)(da)，包(bao)(bao)括(kuo) Hmga2（肺(fei)轉移瘤(liu)(liu)）、Tm4sf1（JAK-STAT 信(xin)號傳導）和 Vim（細胞運(yun)動(dong)），而克(ke)(ke)隆(long)(long) B 的(de)(de)(de)中高表(biao)(biao)達(da)(da)的(de)(de)(de)包(bao)(bao)括(kuo) Aqp5（譜系身份缺失）和上(shang)皮細胞間質轉化標志(zhi)物(wu) S100a4和Vcan25（圖2f,g）。

通過(guo)以上結果，作(zuo)者(zhe)表明了配(pei)對(dui)的(de)slide-DNA-seq和 slide-RNA-seq能夠(gou)對(dui)遺傳上不同的(de)轉移性腫(zhong)瘤克隆及(ji)其(qi)相關細(xi)胞狀態(tai)進行(xing)空間表征(zheng)。

由于(yu)結直(zhi)腸癌是全世界癌癥相(xiang)關死亡(wang)的(de)常(chang)見原因之(zhi)一(yi)(yi)，84% 的(de)此(ci)類腫瘤表現出(chu)染(ran)(ran)色體不穩定性(xing)(xing)。同(tong)時作(zuo)者也(ye)想(xiang)確定slide-DNA-seq是否可以(yi)在(zai)原發性(xing)(xing)人類腫瘤中(zhong)從頭檢(jian)測(ce)克隆異質性(xing)(xing)。基(ji)于(yu)此(ci)，作(zuo)者從IIIB期結直(zhi)腸腫瘤中(zhong)選(xuan)擇了一(yi)(yi)個(ge)(ge)樣本。和之(zhi)前一(yi)(yi)樣，作(zuo)者在(zai)連續切片(pian)上進行了H&E染(ran)(ran)色、多重免疫組織化學和slide-DNA-seq（圖3a）。首先，檢(jian)查H&E染(ran)(ran)色發現許多直(zhi)徑約(yue)100-500微米的(de)局部腫瘤細(xi)(xi)胞(bao)聚集(ji)體。假設這些聚集(ji)體中(zhong)的(de)每一(yi)(yi)個(ge)(ge)都可能來自(zi)單(dan)個(ge)(ge)克隆譜系，可能是由于(yu)遷移受到限制，作(zuo)者猜測(ce)也(ye)有可能是每個(ge)(ge)聚集(ji)體包(bao)含來自(zi)不同(tong)譜系的(de)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)混合(he)物，表明是細(xi)(xi)胞(bao)混合(he)的(de)結果。

那(nei)為了驗(yan)證上(shang)述可能，與(yu)上(shang)文所述方法類似(si)，作(zuo)者進行了PCA和無監督聚(ju)類，產生了三個(ge)不同(tong)的(de)(de)(de)基因組圖(tu)譜（圖(tu)3b）。其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)一(yi)個(ge)簇的(de)(de)(de)空間(jian)分(fen)布在(zai)視覺上(shang)與(yu)H&E染(ran)色中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)正常組織(zhi)(zhi)一(yi)致（圖(tu)3b右，藍色區域），其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)也包括中(zhong)(zhong)等PC1評分(fen)的(de)(de)(de)區域，表明含有CNA的(de)(de)(de)癌細胞(bao)(bao)豐度較低。相(xiang)比之(zhi)下，其(qi)(qi)他兩(liang)個(ge)集群顯示出(chu)較高的(de)(de)(de)PC1分(fen)數，并(bing)且(qie)在(zai)空間(jian)上(shang)僅限(xian)于(yu)不同(tong)的(de)(de)(de)腫瘤(liu)(liu)(liu)聚(ju)集體(ti)，這(zhe)支(zhi)持了每(mei)個(ge)聚(ju)集體(ti)起源(yuan)于(yu)單(dan)一(yi)譜系的(de)(de)(de)假設。與(yu)之(zhi)前的(de)(de)(de)報(bao)道類似(si)，單(dan)個(ge)結(jie)直腸腫瘤(liu)(liu)(liu)細胞(bao)(bao)在(zai)腺體(ti)組織(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)播種，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)相(xiang)鄰細胞(bao)(bao)共(gong)(gong)享最近的(de)(de)(de)共(gong)(gong)同(tong)祖(zu)先(xian)。作(zuo)者通過slide-DNA-seq、H&E 染(ran)色和腫瘤(liu)(liu)(liu)標志物MKI67、免(mian)疫(yi)標志物CD45的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)組織(zhi)(zhi)化共(gong)(gong)同(tong)分(fen)析(xi)驗(yan)證了slide-DNA-seq檢測到(dao)的(de)(de)(de)腫瘤(liu)(liu)(liu)結(jie)構（圖(tu)3c）。

接下來作者(zhe)對(dui)(dui)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)克(ke)隆(long)(long)(long)型(xing)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)畸(ji)(ji)變(bian)進(jin)行了描述。作者(zhe)發(fa)現了幾種遺傳(chuan)畸(ji)(ji)變(bian)，包(bao)(bao)(bao)括 chr8q 擴增(zeng)和(he)chr15 和(he)chr18的(de)(de)(de)(de)(de)缺(que)失(shi)，它們在所(suo)有腫瘤區(qu)域(yu)中(zhong)共享，表明它們在腫瘤進(jin)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)早期(qi)出現并且可能在腫瘤起始中(zhong)起重要作用(yong)。chr8q擴增(zeng)包(bao)(bao)(bao)含已知促進(jin)腫瘤進(jin)展的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因，包(bao)(bao)(bao)括原癌(ai)基(ji)因MYC和(he)MYBL134，而(er)(er)chr15的(de)(de)(de)(de)(de)缺(que)失(shi)導致基(ji)因組(zu)穩定性(xing)所(suo)需的(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)個(ge)基(ji)因丟失(shi)，包(bao)(bao)(bao)括TP53BP135、RAD5136和(he)FAN137。與(yu)這(zhe)(zhe)些共同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)畸(ji)(ji)變(bian)相反，作者(zhe)觀察到chr1q、chr7和(he)chr20的(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)克(ke)隆(long)(long)(long)擴增(zeng)，這(zhe)(zhe)可能發(fa)生在進(jin)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)后期(qi)（圖(tu)3d，e）。值得注意的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，先前對(dui)(dui)結直腸(chang)癌(ai)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)析將chr7p擴增(zeng)歸類為(wei)(wei)典型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)克(ke)隆(long)(long)(long)（而(er)(er)不(bu)是(shi)亞(ya)克(ke)隆(long)(long)(long)）事(shi)件，而(er)(er)chr20p的(de)(de)(de)(de)(de)丟失(shi)和(he)獲得都被確(que)定為(wei)(wei)頻繁的(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)克(ke)隆(long)(long)(long)畸(ji)(ji)變(bian)。這(zhe)(zhe)些事(shi)件的(de)(de)(de)(de)(de)檢測和(he)時間分(fen)類證明了slide-DNA-seq在研究克(ke)隆(long)(long)(long)異質性(xing)進(jin)化(hua)方(fang)面的(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)用(yong)性(xing)。

為了驗證這(zhe)些遺(yi)傳畸(ji)(ji)變，作(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)對(dui)同一結直(zhi)腸腫(zhong)瘤(liu)進(jin)(jin)行了單(dan)細(xi)胞全(quan)基因組測序 (scWGS)。這(zhe)種(zhong)方法從(cong)整(zheng)個腫(zhong)瘤(liu)中進(jin)(jin)行細(xi)胞取樣（比slide-DNA-seq組織切片多100倍(bei)的(de)(de)(de)(de)樣本量(liang)），由此可(ke)能(neng)會識別出額外的(de)(de)(de)(de)亞克隆。與這(zhe)一預期一致(zhi)，對(dui)2,274個高(gao)(gao)覆蓋(gai)率(lv)單(dan)細(xi)胞CNA譜的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)析產生一個正常簇(cu)和五個腫(zhong)瘤(liu)簇(cu)，其中一些類似于幻燈片-DNA-seq CNA譜（圖3f）。然(ran)后，作(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)試(shi)圖將高(gao)(gao)覆蓋(gai)率(lv)測序映射到(dao)slide-DNA-seq陣列(lie)上(shang)，以增強分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)識別CAN。空(kong)間(jian)區域主要匹(pi)配兩個單(dan)獨的(de)(de)(de)(de)scWGS簇(cu)僅(jin)支持使用slide-DNA-seq進(jin)(jin)行的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)析，同時作(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)還(huan)發現了一個具有明顯遺(yi)傳畸(ji)(ji)變的(de)(de)(de)(de)小區域，該區域僅(jin)在 scWGS數據覆蓋(gai)率(lv)較高(gao)(gao)時才顯示(shi)。在展示(shi)了改進(jin)(jin)的(de)(de)(de)(de)空(kong)間(jian)分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)后，作(zuo)者(zhe)(zhe)(zhe)以100kb的(de)(de)(de)(de)基因組分(fen)(fen)辨(bian)率(lv)重新分(fen)(fen)析了匹(pi)配的(de)(de)(de)(de)scWGS簇(cu)，揭(jie)示(shi)了第8號染(ran)色體(ti)(ti)中復雜的(de)(de)(de)(de)CNA圖譜（圖3g）。

最后，為(wei)了展示多模(mo)態空間測序方法的(de)獨特能力，作者(zhe)試圖量化腫(zhong)瘤(liu)轉錄程序如何(he)受遺傳和環境因(yin)(yin)素(su)的(de)控制。作者(zhe)首先對(dui)來自結(jie)直腸腫(zhong)瘤(liu)附近區(qu)域(yu)的(de)連續切片進行(xing)H&E染(ran)色、slide-DNA-seq和slide-RNA-seqV2（圖4a），并(bing)整合病理、基因(yin)(yin)組和轉錄組信息。然后作者(zhe)確定(ding)了腫(zhong)瘤(liu)細胞的(de)不同空間區(qu)域(yu)（圖4b），并(bing)繼續為(wei)每個(ge)區(qu)域(yu)分配(pei)亞克隆身份（圖4c）同時并(bing)量化局部腫(zhong)瘤(liu)密度（圖4d）。

考慮亞克隆身份（細胞(bao)內在）和(he)腫(zhong)(zhong)瘤密(mi)度（細胞(bao)外在）水平(ping)，作(zuo)者使(shi)用去卷積的(de)(de)方法解(jie)析這些因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)素如(ru)何促(cu)進結直腸腫(zhong)(zhong)瘤的(de)(de)轉錄程序。基(ji)(ji)(ji)(ji)于方差(cha)分(fen)解(jie)方法，對于每個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，計算亞克隆同(tong)一性(xing)(xing)解(jie)釋(shi)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)表達(da)方差(cha)、腫(zhong)(zhong)瘤密(mi)度和(he)無(wu)法解(jie)釋(shi)的(de)(de)方差(cha)的(de)(de)百分(fen)比。slide-RNA-seq檢測到的(de)(de)25,074個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)中(zhong)，412個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)與(yu)亞克隆同(tong)一性(xing)(xing)顯(xian)著相(xiang)(xiang)關(guan)，638個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)與(yu)腫(zhong)(zhong)瘤密(mi)度相(xiang)(xiang)關(guan)，1,098個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)與(yu)兩(liang)者的(de)(de)組(zu)合相(xiang)(xiang)關(guan)（P<0.05，方差(cha)解(jie)釋(shi) >30%，圖(tu)4e）。與(yu)亞克隆同(tong)一性(xing)(xing)相(xiang)(xiang)關(guan)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)包括(kuo)位于擴增區域(yu)的(de)(de)已知(zhi)癌癥基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，例如(ru)PLAG1，chr8q39上的(de)(de)癌基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)和(he)MCM7，chr7q上參(can)與(yu)DNA復制(zhi)起(qi)始的(de)(de)MYC靶基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（圖(tu)4f）。值(zhi)得注意(yi)的(de)(de)腫(zhong)(zhong)瘤密(mi)度相(xiang)(xiang)關(guan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)包括(kuo) LGALS341（也稱為(wei)(wei)galectin-3），它(ta)有(you)助于腫(zhong)(zhong)瘤微(wei)環境中(zhong)的(de)(de)免疫抑制(zhi)，以及PROM1（也稱為(wei)(wei)CD133），它(ta)對腸道穩態、再生和(he)腫(zhong)(zhong)瘤起(qi)始起(qi)重(zhong)要作(zuo)用（圖(tu)4g）。

除了(le)表征(zheng)單(dan)個基(ji)因(yin)，我(wo)們(men)還(huan)進行了(le)基(ji)因(yin)集(ji)富集(ji)分(fen)析(xi)以確定(ding)哪些分(fen)子途徑(jing)與(yu)亞克隆(long)(long)或(huo)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)密(mi)切相關（圖(tu)(tu)4h）。該分(fen)析(xi)表明，亞克隆(long)(long)差異主要(yao)改變(bian)了(le)參與(yu)細(xi)胞(bao)生(sheng)長和(he)(he)(he)增殖的(de)(de)基(ji)因(yin)的(de)(de)表達，其中MYC和(he)(he)(he)E2F靶基(ji)因(yin)代表了(le)亞克隆(long)(long)1的(de)(de)最高(gao)(gao)hallmark基(ji)因(yin)集(ji)。相比之下，與(yu)高(gao)(gao)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)密(mi)度相關的(de)(de)基(ji)因(yin)最富集(ji)細(xi)胞(bao)粘(zhan)(zhan)附分(fen)子和(he)(he)(he)鈣(gai)粘(zhan)(zhan)蛋(dan)白結合特性(xing)（圖(tu)(tu)4i），包括細(xi)胞(bao)外基(ji)質成分(fen)基(ji)因(yin)COL3A1、肌(ji)動蛋(dan)白調(diao)節(jie)基(ji)因(yin)FLNB和(he)(he)(he)CALD1，以及機械轉導調(diao)節(jie)基(ji)因(yin)ITGB2（也稱為CD18）。值得注意的(de)(de)是，細(xi)胞(bao)外基(ji)質僵(jiang)化和(he)(he)(he)重塑被(bei)認(ren)為可(ke)以促進細(xi)胞(bao)增殖和(he)(he)(he)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)進展，這(zhe)可(ke)能(neng)導致(zhi)高(gao)(gao)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)胞(bao)密(mi)度。總體而言，這(zhe)些分(fen)析(xi)證明了(le)這(zhe)種多模(mo)態方(fang)法在解耦和(he)(he)(he)量化遺傳和(he)(he)(he)環境(jing)因(yin)素對基(ji)因(yin)表達的(de)(de)貢獻(xian)方(fang)面的(de)(de)實用(yong)性(xing)。

至此，我(wo)們已(yi)經為(wei)大家介紹了(le)單細胞轉錄(lu)組(zu)(zu)，單細胞ATAC，單細胞cut-tag，單細胞基因組(zu)(zu)等方法應(ying)用(yong)。不(bu)難看出，多(duo)組(zu)(zu)學(xue)(xue)應(ying)用(yong)以及從bulk紛(fen)紛(fen)過(guo)渡到單細胞層面(mian)。特別是(shi)多(duo)模(mo)態(tai)這種多(duo)種組(zu)(zu)學(xue)(xue)聯合分析的(de)方法，在解析復(fu)雜(za)疾病是(shi)十分有效的(de)。歡迎各位老師同學(xue)(xue)聯系我(wo)們，共同探究(jiu)單細胞多(duo)組(zu)(zu)學(xue)(xue)的(de)應(ying)用(yong)。