2017-07-12
SMRT（Single Molecule, Real-Time）測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)，即單分子(zi)實時測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)，該方法基于納米小孔的(de)(de)單分子(zi)讀(du)(du)取技術(shu)，無(wu)需(xu)擴增即可快速完成序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列讀(du)(du)取。Pacific Biosciences自(zi)2013年成功推出(chu)商業化(hua)的(de)(de)三代(dai)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)儀PacBio RSII后，三代(dai)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)開(kai)始被(bei)廣泛應用(yong)于基因組(zu)(zu)學、轉錄組(zu)(zu)學研究中(zhong)。三代(dai)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)技術(shu)通過其獨有的(de)(de)環(huan)形(xing)一致(zhi)性測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)模式（Circular-consensus sequence，CCS），極(ji)大提高(gao)單堿基測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)(de)準確率，遠超Illumina等二代(dai)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)技術(shu)。與(yu)傳統轉錄組(zu)(zu)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)項(xiang)目相比(bi)，利用(yong)PacBio平臺的(de)(de)全長轉錄組(zu)(zu)測(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)技術(shu)可以直接獲(huo)得mRNA的(de)(de)全長，保證(zheng)了mRNA序(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)(xu)列的(de)(de)精確性。
2016年6月，南開大學發(fa)表題為(wei)(wei)PacBio full-length transcriptome profiling of insect mitochondrial gene expression的文章，以黃斑蝽線(xian)粒(li)體為(wei)(wei)研究對象，通過全長轉(zhuan)錄組測序，揭示線(xian)粒(li)體基因(yin)轉(zhuan)錄、RNA加(jia)工、mRNA成熟過程及rRNA結構，并(bing)優化(hua)和提(ti)升了基因(yin)組的注釋。
1 研究目的
第三代測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)(shu)與(yu)二(er)代測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)(shu)在讀長上有明顯優(you)勢。期望(wang)利用(yong)三代測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)(shu)的優(you)勢提升昆蟲線粒體基因(yin)組注釋信息并獲取cDNA的全長；另一方(fang)面，建(jian)立一個新方(fang)法(fa)，用(yong)以研究線粒體基因(yin)轉錄(lu)、RNA加工、mRNA成熟及rRNA結構研究等(deng)科學問題(ti)。
2 研(yan)究方(fang)法
取(qu)黃斑蝽雌體(ti)和(he)雄體(ti)各一只(zhi)進行(xing)混樣，提取(qu)總RNA后，利用SMARScribe試劑(ji)盒將mRNA進行(xing)反轉錄獲得cDNA，構(gou)建好(hao)的文庫用PacBio平臺進行(xing)測序(xu)。
3 分(fen)析結(jie)果
1) 線粒體轉錄組(zu)圖譜.
黃(huang)斑(ban)蝽基(ji)因組(zu)調到J(+)鏈(lian)，組(zu)裝(zhuang)轉錄本在J(+)鏈(lian)用紅(hong)色表(biao)示，N(-)鏈(lian)用藍色表(biao)示，綠色代表(biao)tRNA的(de)氨基(ji)酸。
2) mRNA和rRNA成熟
成(cheng)熟的線粒(li)體(ti)(ti)mRNA和rRNA都具(ju)有3’ployA尾結(jie)構。具(ju)體(ti)(ti)結(jie)構見下圖(tu)，TIS代表(biao)轉錄起始位點，m7G代表(biao)7-甲基(ji)鳥苷帽子(zi)。
3) 多(duo)順反子(zi)轉錄本(ben)、RNA前(qian)體和RNA加工(gong)
以ND3和 COII多順反子(zi)轉錄本為支撐，tRNA為結尾(wei)的剪切方式(shi)稱為“反式(shi)剪切”模型，以mRNA和rRNA為結尾(wei)的剪切方式(shi)稱為“正向剪切”模型。
本全文作者發現線粒體rRNA存在3’多聚腺苷酸化，5’存在m7G，12S rRNA的isoforms存在多樣性；同時發現線粒體基因的多順反子轉錄本和自然反義轉錄本。
4 參考文獻(xian)
Gao S, Ren Y, Sun Y, et al. PacBio full-length transcriptome profiling of insect mitochondrial gene expression[J]. Rna Biology, 2016, 13(9):820.
2016年，派森諾生物在原有的PacBio RS II三代高通量測(ce)序儀基礎上，率先(xian)部(bu)署最新款PacBio Sequel測(ce)序儀，并已投入使用，助力全長轉錄(lu)組測(ce)序研(yan)究(jiu)！
